基质细胞衍生因子－1α及其受体在糖尿病大鼠心肌病变中的表达及意义(1)
林安华 雷闽湘 谢晓云 徐寒松
摘要：目的 观察糖尿病大鼠心肌病变与基质细胞衍生因子-1α(SDF-1d)及其受体(CXCR-4)的关系。方法以链脲佐菌素(STZ)诱导建立糖尿病大鼠模型。随机分为1个月病程组(M1组)、3个月病程组(M3组)、5个月病程组(M5组)。心肌切片后行SDF-1α，CXCR-4及血管内皮生长因子(VEGF)免疫组化，抗vWF抗体染色心肌微血管计数，半定量反转录聚合酶链反应(RTPCR)检测SDF-1α,CXCR-4及VEGFmRNA在大鼠心肌中的表达水平。结果 随着病程的延长，心肌组织中SDF-1α，CXCR-4袁达水平逐渐增高，与正常对照组相比，造模后1个月就有增高，5个月时增高最明显，而心肌组织中VEGF表达无明显改变：心肌微血管计数显示造模后5个月心肌内微血管数量明显减少。结论 糖尿痛心肌病变时SDF-1α/CXCR-4在心肌中的表达水平随糖尿病痛程延长逐步增高，而VEGF表达无明显改变，糖尿病心肌病变时微血管减少可能与VEGF表达不足有关。
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关键词：糖尿病；心肌病变；基质细胞衍生因子-1α；CXCR-4；大鼠
中图分类号：R587.1 R255.4 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2007)07-0601-03
糖尿病心肌病变是由代谢紊乱触发，致心肌细胞凋亡增加，纤维化，出现心律失常，进行性心功能不全的一种糖尿病慢性并发症，是糖尿病病人死亡主要原因之一，心肌内微血管病变是其主要病理改变。基质细胞衍生因子(stuomal cell-derived factor-1α，SDF-1α)是趋化作用细胞因子(chemotaxis)CXC亚族的一员。研究表明，SDF-1α在细胞迁移过程中发挥着重要作用，与血管生成密切相关，通过与其特异性受体CXCR-4结合而发挥趋化作用，促进造血干/祖细胞逆SDF-1浓度梯度移行和增殖，诱导新生血管形成。在研究SDF-1α对人微血管内皮细胞的作用时发现，SDF-1α能促进内皮细胞增殖迁移，并能促进内皮细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)，从而促进血管发生，表明SDI、1α参与了微血管内皮细胞形成新生血管的过程。本研究通过链脲佐菌素(STZ)诱导建立糖尿病心肌病变动物模型，应用免疫组化和RT-PCR方法研究糖尿病心肌病变心肌SDF-1α，CXCR-4及VEGF的表达，探讨糖尿病心肌病变可能的发病机制。
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1 材料与方法
1.1 材料 雄性SD大鼠60只，体量200g±20g，由中南大学医学动物部提供；链脲佐菌素(Streptozotocin，美国Sigma公司)；罗氏血糖仪及试纸；SDF-1α，CXCR-4，VEGF及抗vWF单抗(武汉博士德公司)；S-P试剂盒(北京中杉金桥公司)；Trizol和反转录试剂盒(Invitrogen公司)；Taq酶(大连Takara公司)；引物(上海生物工程公司合成)；PCR扩增仪(德国Biometra公司)；UVI.pro凝胶成像与分析系统(华粤公司)。
1.2 方法 实验大鼠随机分成正常对照组(NC组)和糖尿病(DM组)，每组又分3个亚组，即1个月组(M1组)、3个月组(MS组)、5个月组(M5组)各10只。禁食12h后，用新鲜配置0.1mmol/L.pH4.5的枸橼酸盐缓冲液稀释STZ(10.g/L)，以60mg/kg一次性腹腔内注射诱导建立糖尿病大鼠模型，正常组以等体积枸橼酸盐缓冲液一次性腹腔内注射。1d及3d后尾静脉采血测血糖≥16.7mmol/L确定模型并纳入试验。每5d测大鼠体重、血糖1次，普通颗粒饲料喂养，自由饮水。
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分别于造模后1个月、3个月、5个月末称体重、测空腹血糖后处死大鼠，取心脏组织应用免疫组化S-P法检测心肌组织SDF-1α，CXCR-4及VEGF的表达。
抗vWF抗体染色心肌微血管计数，第Ⅷ因子相关抗原在血管内皮细胞表达，应用免疫组化S-P法对各组大鼠心肌组织中第Ⅷ因子相关抗原进行测定，参照Weidner法计数心肌微血管(MV)。
取心肌置于去PdNA酶的冻存管液氮中保用于Trizol提取心肌总RNA，测定纯度及含量。
1.3 统计学处理 采用SPSS 11.5进行统计学分析，结果以均数±标准差(x±s)表示，采用成组设计资料两样本均数比较t检验。
2 结果
2.1 一般状况观察结果 DM大鼠均成模，无血糖返回正常现象，食量、饮水量及尿量均显著增加，同时体质量增长缓慢，并出现皮毛枯黄、皮下脓肿等。NC组大鼠无死亡，DM组大鼠在M3组、M5组各死亡1只。
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2.2 心肌微血管密度(MVD)计数 第Ⅷ因子相关抗原在血管内皮细胞表达，阳性点在光镜下为单个或呈团块、柱状或已分化成管腔状的内皮细胞，细胞质呈棕黄色至棕褐色，糖尿病大鼠心肌微血管数自造模后M1组开始较NC组就有减少，但无统计学意义，M3组具有统计学意义。
2.3 SDF-1α，CXCR-4及VEGF在心肌组织中免疫组化染色镜下见SDF-1α，CKCR-4及VEGF在正常大鼠及糖尿病大鼠均有表达，表现为心肌微血管内皮细胞胞浆及(或)胞膜棕黄色显色，同时心肌细胞染色也可见棕黄色显色。在DM大鼠心肌中的表达较正常大鼠为明显且其显色强度随DM病程延长逐步增强。
2.4 SDF-1α.CXCR-4及VEGFmRNA的表达量 DM组大鼠心肌组织中SDF-1α，CXCR-4及VEGF mRNA的表达量与同龄NC组大鼠比较，1个月时mRNA表达就明显升高，5个月时增高最明显。
3 讨论
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SDF-1α是新近发现的具有趋化活性的细胞因子，广泛表达于多种组织器官中。近年来研究发现它与血管新生有着密切关系，SDF-1α通过与其特异性受体CXCR-4结合，促进CD34+造血干/祖细胞逆SDF-1α浓度梯度移行和增殖，抑制CD34+造血干/祖细胞凋亡，诱导新生血管形成。Tachibana等研究CXCR-4或SDF-1基因缺乏鼠胚胎期血管系统发生过程时发现，与野生鼠比较，基因缺乏鼠在胚胎期第13.5天循环网就有区别，在野生鼠胚胎中可见肠系膜动静脉的大小分支，而在CXCR-4基因缺乏鼠胚胎中即使血管是正常的其大的分支也被丢失，在SDF-1缺乏鼠胚胎中存在类似表现；另见CXCR-4基因缺乏鼠死于宫内并且在心血管发育中存在缺陷，因而认为SDF-1/CXCR-4是器官及血管形成的重要信号系统。SDF-1α/CXCR-4轴在CD34+造血干/祖细胞的归巢过程起着重要作用，并能诱导血管内皮细胞迁移增殖。Mirshahi等研究SDF-1对人微血管内皮细胞的作用时发现，SDF-1能促进内皮细胞增殖迁移，并能促进内皮细胞表达血管内皮生长因子，从而促进血管发生，表明SDF-1参与了微
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摘要：目的 观察糖尿病大鼠心肌病变与基质细胞衍生因子-1α(SDF-1d)及其受体(CXCR-4)的关系。方法以链脲佐菌素(STZ)诱导建立糖尿病大鼠模型。随机分为1个月病程组(M1组)、3个月病程组(M3组)、5个月病程组(M5组)。心肌切片后行SDF-1α，CXCR-4及血管内皮生长因子(VEGF)免疫组化，抗vWF抗体染色心肌微血管计数，半定量反转录聚合酶链反应(RTPCR)检测SDF-1α,CXCR-4及VEGFmRNA在大鼠心肌中的表达水平。结果 随着病程的延长，心肌组织中SDF-1α，CXCR-4袁达水平逐渐增高，与正常对照组相比，造模后1个月就有增高，5个月时增高最明显，而心肌组织中VEGF表达无明显改变：心肌微血管计数显示造模后5个月心肌内微血管数量明显减少。结论 糖尿痛心肌病变时SDF-1α/CXCR-4在心肌中的表达水平随糖尿病痛程延长逐步增高，而VEGF表达无明显改变，糖尿病心肌病变时微血管减少可能与VEGF表达不足有关。
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关键词：糖尿病；心肌病变；基质细胞衍生因子-1α；CXCR-4；大鼠
中图分类号：R587.1 R255.4 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2007)07-0601-03
糖尿病心肌病变是由代谢紊乱触发，致心肌细胞凋亡增加，纤维化，出现心律失常，进行性心功能不全的一种糖尿病慢性并发症，是糖尿病病人死亡主要原因之一，心肌内微血管病变是其主要病理改变。基质细胞衍生因子(stuomal cell-derived factor-1α，SDF-1α)是趋化作用细胞因子(chemotaxis)CXC亚族的一员。研究表明，SDF-1α在细胞迁移过程中发挥着重要作用，与血管生成密切相关，通过与其特异性受体CXCR-4结合而发挥趋化作用，促进造血干/祖细胞逆SDF-1浓度梯度移行和增殖，诱导新生血管形成。在研究SDF-1α对人微血管内皮细胞的作用时发现，SDF-1α能促进内皮细胞增殖迁移，并能促进内皮细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)，从而促进血管发生，表明SDI、1α参与了微血管内皮细胞形成新生血管的过程。本研究通过链脲佐菌素(STZ)诱导建立糖尿病心肌病变动物模型，应用免疫组化和RT-PCR方法研究糖尿病心肌病变心肌SDF-1α，CXCR-4及VEGF的表达，探讨糖尿病心肌病变可能的发病机制。
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1 材料与方法
1.1 材料 雄性SD大鼠60只，体量200g±20g，由中南大学医学动物部提供；链脲佐菌素(Streptozotocin，美国Sigma公司)；罗氏血糖仪及试纸；SDF-1α，CXCR-4，VEGF及抗vWF单抗(武汉博士德公司)；S-P试剂盒(北京中杉金桥公司)；Trizol和反转录试剂盒(Invitrogen公司)；Taq酶(大连Takara公司)；引物(上海生物工程公司合成)；PCR扩增仪(德国Biometra公司)；UVI.pro凝胶成像与分析系统(华粤公司)。
1.2 方法 实验大鼠随机分成正常对照组(NC组)和糖尿病(DM组)，每组又分3个亚组，即1个月组(M1组)、3个月组(MS组)、5个月组(M5组)各10只。禁食12h后，用新鲜配置0.1mmol/L.pH4.5的枸橼酸盐缓冲液稀释STZ(10.g/L)，以60mg/kg一次性腹腔内注射诱导建立糖尿病大鼠模型，正常组以等体积枸橼酸盐缓冲液一次性腹腔内注射。1d及3d后尾静脉采血测血糖≥16.7mmol/L确定模型并纳入试验。每5d测大鼠体重、血糖1次，普通颗粒饲料喂养，自由饮水。
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分别于造模后1个月、3个月、5个月末称体重、测空腹血糖后处死大鼠，取心脏组织应用免疫组化S-P法检测心肌组织SDF-1α，CXCR-4及VEGF的表达。
抗vWF抗体染色心肌微血管计数，第Ⅷ因子相关抗原在血管内皮细胞表达，应用免疫组化S-P法对各组大鼠心肌组织中第Ⅷ因子相关抗原进行测定，参照Weidner法计数心肌微血管(MV)。
取心肌置于去PdNA酶的冻存管液氮中保用于Trizol提取心肌总RNA，测定纯度及含量。
1.3 统计学处理 采用SPSS 11.5进行统计学分析，结果以均数±标准差(x±s)表示，采用成组设计资料两样本均数比较t检验。
2 结果
2.1 一般状况观察结果 DM大鼠均成模，无血糖返回正常现象，食量、饮水量及尿量均显著增加，同时体质量增长缓慢，并出现皮毛枯黄、皮下脓肿等。NC组大鼠无死亡，DM组大鼠在M3组、M5组各死亡1只。
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2.2 心肌微血管密度(MVD)计数 第Ⅷ因子相关抗原在血管内皮细胞表达，阳性点在光镜下为单个或呈团块、柱状或已分化成管腔状的内皮细胞，细胞质呈棕黄色至棕褐色，糖尿病大鼠心肌微血管数自造模后M1组开始较NC组就有减少，但无统计学意义，M3组具有统计学意义。
2.3 SDF-1α，CXCR-4及VEGF在心肌组织中免疫组化染色镜下见SDF-1α，CKCR-4及VEGF在正常大鼠及糖尿病大鼠均有表达，表现为心肌微血管内皮细胞胞浆及(或)胞膜棕黄色显色，同时心肌细胞染色也可见棕黄色显色。在DM大鼠心肌中的表达较正常大鼠为明显且其显色强度随DM病程延长逐步增强。
2.4 SDF-1α.CXCR-4及VEGFmRNA的表达量 DM组大鼠心肌组织中SDF-1α，CXCR-4及VEGF mRNA的表达量与同龄NC组大鼠比较，1个月时mRNA表达就明显升高，5个月时增高最明显。
3 讨论
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SDF-1α是新近发现的具有趋化活性的细胞因子，广泛表达于多种组织器官中。近年来研究发现它与血管新生有着密切关系，SDF-1α通过与其特异性受体CXCR-4结合，促进CD34+造血干/祖细胞逆SDF-1α浓度梯度移行和增殖，抑制CD34+造血干/祖细胞凋亡，诱导新生血管形成。Tachibana等研究CXCR-4或SDF-1基因缺乏鼠胚胎期血管系统发生过程时发现，与野生鼠比较，基因缺乏鼠在胚胎期第13.5天循环网就有区别，在野生鼠胚胎中可见肠系膜动静脉的大小分支，而在CXCR-4基因缺乏鼠胚胎中即使血管是正常的其大的分支也被丢失，在SDF-1缺乏鼠胚胎中存在类似表现；另见CXCR-4基因缺乏鼠死于宫内并且在心血管发育中存在缺陷，因而认为SDF-1/CXCR-4是器官及血管形成的重要信号系统。SDF-1α/CXCR-4轴在CD34+造血干/祖细胞的归巢过程起着重要作用，并能诱导血管内皮细胞迁移增殖。Mirshahi等研究SDF-1对人微血管内皮细胞的作用时发现，SDF-1能促进内皮细胞增殖迁移，并能促进内皮细胞表达血管内皮生长因子，从而促进血管发生，表明SDF-1参与了微
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