川崎病患儿循环内皮细胞的变化及意义
摘要：目的：了解川崎病(KD)患儿外周血循环内皮细胞(CEC)的数量及其临床意义。方法：采用密度梯度离心法和流式细胞仪检测28例KD患儿30名正常儿童的血液标本。结果：KD患儿和正常儿童的CEC数量分别是(7.8±4.2)/mL和(3.7±1.1)/mL，两者之间的差异有统计学意义(P<0.01)；冠状动脉损伤组(CAL组)患儿CEC数量(9.7±1.9)/mL，高于无冠状动脉损伤组(Non-CAL组)患儿的(5.5±2.6)/mL，两者之间的差异有统计意义(P<0.11)。结论：内皮损伤在KD患儿的发病中具有重要意义，测定CEC对判断病情及有无冠状动脉病变有重要意义。
关键词：川崎病；循环内皮细胞；冠状动脉
中图分类号：R725.4 文献标识码：B 文章编号：1672-1349(2007)09-0884-02
川崎病(Kawasaki disease，KD)是一种以全身血管炎为主要病变的急性发热出疹性疾病，这种血管炎以免疫系统活化和血管内皮系统广泛损害为特征，是心血管系统病理损伤的重要基础。KID多侵犯冠状动脉，已取代风湿热并成为我国小儿后天性心脏病的主要病因之一。其发病机制仍不清楚，既往的研究发现一些自身抗体与细胞因子可能与KD血管损伤过程有关。循环内皮细胞(circulating endothelial cell，CEC)是指外周血中测得的血管内皮细胞(vascular endothehal cells，VEC)，其数量的变化可反映血管内皮受损的程度，是目前唯一可作为活体组织中反映VEC损伤的直接而特异的标志物，因而越来越受到国内外学者的广泛关注，但在KD患儿中的研究报道不多，其是否与冠状动脉病变的形成有关尚不清楚。本研究对28例KD患儿的CEC数量进行检测，旨在探讨内皮损伤在KD中的意义，以及CEC与合并冠状动脉病变之间的关系。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 临床资料：川崎病组28例为2006年1月-2007年5月住院的KD患儿，其中男15例，女13例，年龄2月至6岁，病程6d～18d。均符合日本MCLS研究会1984年修订的诊断标准。根据KD患儿心脏彩色多普勒检查结果将其分为两组：合并冠状动脉损伤组(CAL组)12例，无冠状动脉损伤组(Non-CAL组)16例。全部病例均给予阿司匹林联合静脉丙种球蛋白(IVIG)治疗。对照组为30名健康体检儿童，男18名，女12名，年龄6个月至6岁，均排除了心、肺、肝、肾等疾病，年龄及性别与川崎病组差异无统计学意义。
1.2标本采集：抽取急性期(发热5d～7d，丙种球蛋白治疗前)KD患儿和对照组儿童肘正中静脉血5 mL，加入枸橼酸钠真空采血管(美国BD公司产品)中，弃去最初采集的2 n1IJ血，以避免静脉穿刺时脱落的内皮细胞掺入。新鲜样本6h之内进行样本处理。
1.3 仪器与试剂：EPICS PROFILEⅡ型流式细胞仪(Coulter，美国)；ACAS Ultlma激光共聚焦显微镜(Meridian，美国)；兔抗人多克隆yon Willebrand因子抗体(yWF)和FITC-羊抗兔IgG(军事医学科学院，中国)；1.060 g/mL和1.045 g/mL Peroall分层液(中国医学科学院血液学研究所)，FITC-CD31小鼠抗人单克隆抗体(Coulter，美国)。
, 百拇医药
1.4 实验方法：CEC的鉴定，取细胞悬液少许涂片，干燥后用甲醇固定5 min，用PBS漂洗3次，干后滴加免抗入因子Ⅷ相关抗原血清，置于37℃中孵育30 min后取出，再次用PBS漂洗3次，干后滴加FITC标记的羊抗兔IgG；荧光抗体，于后滴加缓冲甘油，置激光共聚焦显微镜下观察。
1.5 统计学处理：应用SPSS11.5统计软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验。
2 结 果
2.1 川崎病组与对照组CEC数量比较川崎病组CEC数量为(7.8±4.2)/mL，高于对照组的(3.7±1.1)/mL，差异有统计学意义(P<0.01)。
2.2 川崎病CAL组与Non-CAL组CEC数量比较，CAL组患儿CEC数量为(9.7±1.9)/mL高于Non-CAL组的(5.5±2.6)/mL，相比差异有统计学意义(P<0.01)。
, 百拇医药
3 讨 论
CEC可直接而特异地反映活体内内皮细胞(EC)的损伤情况，且主要反映EC的脱落性损伤。在某些病理情况下，VEC自基膜脱落至血管腔内，形成CEC，使CEC数量明显增加，这种变化可灵敏地反映血管内皮的损伤程度。因此，CEC可作为活体内血管损伤特异而直接的指示物。CEC是判定血管炎的最佳标记物，尤其是在判定抗中性粒细胞胞浆抗体相关的血管炎中，其敏感度要远远超过现用的抗中性粒细胞胞浆抗体效价。
本研究的结果显示，KD组的CEC较对照组明显增多(P<0.01)，表明KD存在有VEC的损伤及脱落，与文献报道一致。川崎病内皮细胞损伤的机制有，川崎病时免疫系统异常活化和紊乱，使大量细胞因子和炎性介质被释放，如白细胞介素、γ-干扰素、肿瘤坏死因子和超氧自由基等。这些异常增多的炎性介质既可直接损伤血管内皮细胞，也可诱导机体产生抗内皮细胞抗体(AEA)、抗中性粒细胞抗体(ANCA)及抗血小板抗体等自身抗体，而发生自身免疫性反应，使血管内皮细胞损伤甚至坏死，而致血管壁的损害。因此可以说CEC是KD内皮细胞损伤的标志物D2J。本研究的另一结果显示，CAL组的CEC较Non-CAL组显著增多(P<0.01)，提示VEC的损伤与冠状动脉损伤呈正相关，CEC的损伤是导致冠状动脉损伤的原因。当然，这一结论还需要有大样本研究进一步证实。
, 百拇医药
检测CEC的方法有多种，主要可分为形态识别计数法、间接免疫荧光抗体法和免疫荧光流式细胞仪计数法等三类。前两类方法虽然简单，易于建立，但实验回收率不高，灵敏度也差，并且费时。本实验应用密度梯度离心的方法从全血中分离CEC，克服了以往方法的缺点，如研究的血液标本不同、分选的方法不同，以及计数的方法不同等等的弊端，具有客观、准确、省时、特异性强及回收率高、取血量少、对内皮细胞损伤小的特点。而且本实验采用流式细胞仪分选的方法，避免了单纯用肉眼进行识别的错判，可用于不同疾病病人血液中CEC的定量检测，值得在临床推广。目前又有一种新的方法——免疫磁珠分选方法问世，该法用血量少，回收率达80%～90%，灵敏度高，特异性强，更为先进。
CEC可作为川崎病血管病变中内皮细胞损伤的标志，预示川崎病发生血管损伤的危险性，了解冠状动脉损害的状况，减轻川崎病对小儿的威胁，为进一步治疗提供理论依据。
本文编辑 王雅洁, 百拇医药(石 岩 阴怀清 栗 红 原平飞)
关键词：川崎病；循环内皮细胞；冠状动脉
中图分类号：R725.4 文献标识码：B 文章编号：1672-1349(2007)09-0884-02
川崎病(Kawasaki disease，KD)是一种以全身血管炎为主要病变的急性发热出疹性疾病，这种血管炎以免疫系统活化和血管内皮系统广泛损害为特征，是心血管系统病理损伤的重要基础。KID多侵犯冠状动脉，已取代风湿热并成为我国小儿后天性心脏病的主要病因之一。其发病机制仍不清楚，既往的研究发现一些自身抗体与细胞因子可能与KD血管损伤过程有关。循环内皮细胞(circulating endothelial cell，CEC)是指外周血中测得的血管内皮细胞(vascular endothehal cells，VEC)，其数量的变化可反映血管内皮受损的程度，是目前唯一可作为活体组织中反映VEC损伤的直接而特异的标志物，因而越来越受到国内外学者的广泛关注，但在KD患儿中的研究报道不多，其是否与冠状动脉病变的形成有关尚不清楚。本研究对28例KD患儿的CEC数量进行检测，旨在探讨内皮损伤在KD中的意义，以及CEC与合并冠状动脉病变之间的关系。
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1 资料与方法
1.1 临床资料：川崎病组28例为2006年1月-2007年5月住院的KD患儿，其中男15例，女13例，年龄2月至6岁，病程6d～18d。均符合日本MCLS研究会1984年修订的诊断标准。根据KD患儿心脏彩色多普勒检查结果将其分为两组：合并冠状动脉损伤组(CAL组)12例，无冠状动脉损伤组(Non-CAL组)16例。全部病例均给予阿司匹林联合静脉丙种球蛋白(IVIG)治疗。对照组为30名健康体检儿童，男18名，女12名，年龄6个月至6岁，均排除了心、肺、肝、肾等疾病，年龄及性别与川崎病组差异无统计学意义。
1.2标本采集：抽取急性期(发热5d～7d，丙种球蛋白治疗前)KD患儿和对照组儿童肘正中静脉血5 mL，加入枸橼酸钠真空采血管(美国BD公司产品)中，弃去最初采集的2 n1IJ血，以避免静脉穿刺时脱落的内皮细胞掺入。新鲜样本6h之内进行样本处理。
1.3 仪器与试剂：EPICS PROFILEⅡ型流式细胞仪(Coulter，美国)；ACAS Ultlma激光共聚焦显微镜(Meridian，美国)；兔抗人多克隆yon Willebrand因子抗体(yWF)和FITC-羊抗兔IgG(军事医学科学院，中国)；1.060 g/mL和1.045 g/mL Peroall分层液(中国医学科学院血液学研究所)，FITC-CD31小鼠抗人单克隆抗体(Coulter，美国)。
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1.4 实验方法：CEC的鉴定，取细胞悬液少许涂片，干燥后用甲醇固定5 min，用PBS漂洗3次，干后滴加免抗入因子Ⅷ相关抗原血清，置于37℃中孵育30 min后取出，再次用PBS漂洗3次，干后滴加FITC标记的羊抗兔IgG；荧光抗体，于后滴加缓冲甘油，置激光共聚焦显微镜下观察。
1.5 统计学处理：应用SPSS11.5统计软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验。
2 结 果
2.1 川崎病组与对照组CEC数量比较川崎病组CEC数量为(7.8±4.2)/mL，高于对照组的(3.7±1.1)/mL，差异有统计学意义(P<0.01)。
2.2 川崎病CAL组与Non-CAL组CEC数量比较，CAL组患儿CEC数量为(9.7±1.9)/mL高于Non-CAL组的(5.5±2.6)/mL，相比差异有统计学意义(P<0.01)。
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3 讨 论
CEC可直接而特异地反映活体内内皮细胞(EC)的损伤情况，且主要反映EC的脱落性损伤。在某些病理情况下，VEC自基膜脱落至血管腔内，形成CEC，使CEC数量明显增加，这种变化可灵敏地反映血管内皮的损伤程度。因此，CEC可作为活体内血管损伤特异而直接的指示物。CEC是判定血管炎的最佳标记物，尤其是在判定抗中性粒细胞胞浆抗体相关的血管炎中，其敏感度要远远超过现用的抗中性粒细胞胞浆抗体效价。
本研究的结果显示，KD组的CEC较对照组明显增多(P<0.01)，表明KD存在有VEC的损伤及脱落，与文献报道一致。川崎病内皮细胞损伤的机制有，川崎病时免疫系统异常活化和紊乱，使大量细胞因子和炎性介质被释放，如白细胞介素、γ-干扰素、肿瘤坏死因子和超氧自由基等。这些异常增多的炎性介质既可直接损伤血管内皮细胞，也可诱导机体产生抗内皮细胞抗体(AEA)、抗中性粒细胞抗体(ANCA)及抗血小板抗体等自身抗体，而发生自身免疫性反应，使血管内皮细胞损伤甚至坏死，而致血管壁的损害。因此可以说CEC是KD内皮细胞损伤的标志物D2J。本研究的另一结果显示，CAL组的CEC较Non-CAL组显著增多(P<0.01)，提示VEC的损伤与冠状动脉损伤呈正相关，CEC的损伤是导致冠状动脉损伤的原因。当然，这一结论还需要有大样本研究进一步证实。
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检测CEC的方法有多种，主要可分为形态识别计数法、间接免疫荧光抗体法和免疫荧光流式细胞仪计数法等三类。前两类方法虽然简单，易于建立，但实验回收率不高，灵敏度也差，并且费时。本实验应用密度梯度离心的方法从全血中分离CEC，克服了以往方法的缺点，如研究的血液标本不同、分选的方法不同，以及计数的方法不同等等的弊端，具有客观、准确、省时、特异性强及回收率高、取血量少、对内皮细胞损伤小的特点。而且本实验采用流式细胞仪分选的方法，避免了单纯用肉眼进行识别的错判，可用于不同疾病病人血液中CEC的定量检测，值得在临床推广。目前又有一种新的方法——免疫磁珠分选方法问世，该法用血量少，回收率达80%～90%，灵敏度高，特异性强，更为先进。
CEC可作为川崎病血管病变中内皮细胞损伤的标志，预示川崎病发生血管损伤的危险性，了解冠状动脉损害的状况，减轻川崎病对小儿的威胁，为进一步治疗提供理论依据。
本文编辑 王雅洁, 百拇医药(石 岩 阴怀清 栗 红 原平飞)