甘精\地特和人胰岛素对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响(1)
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摘要:目的观察甘精、地特和人胰岛素对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响。方法用甘精、地特和人胰岛素干预3T3-L1前脂肪细胞,并用MTT和油红O染色法测定其增殖和分化水平。结果甘精胰岛素(1.013±0.007)可促进前脂肪细胞增殖,地特胰岛素(0.990±0.009)可抑制前脂肪细胞增殖；胰岛素为前脂肪细胞分化的必须成分,促分化作用人胰岛素(0.638±0.006)最强,甘精胰岛素(纯品0.623±0.007，液体0.445±0.006)次之,地特胰岛素(0.412±0.006)最弱。结论不同胰岛素对前脂肪细胞增殖分化的影响不同。
关键词：胰岛素 前脂肪细胞 增殖 分化
中图分类号：R255.4R587.1文献标识码：B文章编号：1672-1349(2011)05-0545-02
糖尿病的发病率呈现快速增长,胰岛素是糖尿病治疗中不可替代的药物。胰岛素的发展经历了动物胰岛素、基因工程人胰岛素和胰岛素类似物三个阶段。甘精胰岛素和地特胰岛素作为胰岛素类似物出现,已广泛应用于临床[1]。脂肪组织是胰岛素的重要靶器官之一,前脂肪细胞具增殖能力,且能分化为脂肪细胞,作用持续于人的一生,其增殖和分化能力影响脂肪组织的构建。本文拟比较甘精、地特和人胰岛素对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响,从而指导临床选择不同的胰岛素对糖尿病患者进行个体化治疗。
1资料与方法
1.1主要实验用品及化学试剂DMEM-F12培养基、胰蛋白酶购自Gibco-BRL公司；胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司；青霉素、链霉素购自华北制药厂；噻唑兰、二甲基亚砜、人胰岛素、甲状腺素、地塞米松、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤均购自Sigma公司；油红O染料购自Amersco公司；地特胰岛素由诺和诺德公司提供；甘精胰岛素液体和纯品由甘李药业有限公司提供。
1.2试验方法
1.2.13T3-L1前脂肪细胞的复苏准备37 ℃的温水,从液氮罐中取出冻存管,迅速投入温水中。在水中来回晃冻存管1 min左右,观察到冻存液基本融化。将冻存管中液体吸入离心管中,1 000/min离心5 min,吸弃上清,加入新的培养基,吹打均匀,使得细胞分散,以104/mL密度接种,放入CO2培养箱中培养。
1.2.2MTT法观察前脂肪细胞增殖前脂肪细胞以104/mL接种于96孔板,37℃、5%CO2培养24 h后,设对照组(含10%胎牛血清的D-MEM/F-12配制的完全培养液)和四组干预组(含10 nmol/L甘精纯品胰岛素、人纯品胰岛素、甘精液体胰岛素、地特液体胰岛素的完全培养液)孵育细胞,隔日一次倒置显微镜下观察细胞并作MTT比色法测增殖。
1.2.3前脂肪细胞分化过程观察前脂肪细胞以104/mL接种于96孔板,D-MEM/F-12(1∶1)基础培养基中添加0.25 μmol/L胰岛素、0.25 μmol/L地塞米松、0.2 nmol/L甲状腺素以及0.5 mmol/L IBMX作分化培养基诱导分化,设对照组(不含胰岛素)和四组干预组(含0.25 μmol/L甘精纯品胰岛素、人纯品胰岛素、甘精液体胰岛素、地特液体胰岛素的分化培养液),3 d后改用不含IBMX的分化培养基诱导直至14 d,隔日一次显微镜观察。用油红O染色和异丙醇抽提的方法进行细胞内脂质含量定量(以OD值表示)。
1.3统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示,用SPSS 13.0统计学软件处理。多组间应用单因素方差分析,两两之间比较采用LSD-t检验。
2结果
2.1不同胰岛素对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响3T3-L1前脂肪细胞在接种16 h左右基本完全贴壁,显微镜下观察形态类似于成纤维细胞,呈棱形、梭形或多角形,细胞核圆形,位于细胞质中央,使用油红O染色完全不能着色。接种后的第4天进入对数增长期,第10天进入增殖平台期。8 d时地特液体胰岛素抑制细胞的增殖(P<0.05)。10 d时甘精纯品胰岛素(P<0.05)、甘精液体胰岛素(P<0.05)促进细胞的增殖,地特液体胰岛素抑制细胞的增殖(P<0.05)。12 d时地特液体胰岛素抑制细胞的增殖(P<0.05)。详见表1。2.2不同胰岛素对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响当前脂肪细胞生长达接触抑制后,以分化培养基可诱导前脂肪细胞分化。前脂肪细胞分化为脂肪细胞后,胞质内可以观察到脂质小滴,并随着分化的进展,胞质内的脂滴迅速增多且多散在,使细胞的形态由多角形变为椭圆形或圆形,油红O可染色。诱导前脂肪细胞分化至第2天时细胞体积开始变大,第4天开始胞质内可以观察到脂质小滴。随分化进程细胞内脂质聚集逐渐增多,4 d到10 d增长迅速,12 d达高峰。对照组为不含胰岛素的分化培养基,只有小部分细胞自行分化,12 d之内无明显变化。前4 d,各干预组间差异无统计学意义(P>0.05)。6 d开始,甘精液体胰岛素与地特液体胰岛素对前脂肪细胞分化影响的差别有统计学意义(P<0.05),地特胰岛素促前脂肪细胞分化的能力弱于甘精胰岛素。8 d时,人胰岛素促前脂肪细胞分化的能力强于甘精胰岛素(P<0.05),地特胰岛素仍弱于甘精胰岛素。详见表2。3讨论
人胰岛素为胰腺β细胞合成和分泌的一种多肽激素,由A链和B链组成,A链含有2 1个氨基酸残基,B链含有30个氨基酸残基。甘精胰岛素是合成的人胰岛素类似物,对结构的改进是将人胰岛素A链21位由甘氨酸取代天冬氨酸,B链末端增加2个精氨酸[2]。地特胰岛素是一种中性的、可溶的、长效胰岛素类似物,它是通过去掉胰岛素肽链上B30位的苏氨酸并通过酰化作用在B29位的赖氨酸上结合了一个14碳的脂肪酸(肉豆蔻酸)而形成[3]。
在增殖实验中,到第8天时地特液体胰岛素开始抑制细胞的增殖直到第12天,第10天时甘精胰岛素促进细胞的增殖。Slieker 等[4]实验表明胰岛素B26-B30 分子结构的改变会影响与IGF-IR 的亲和力,最终影响胰岛素促进有丝分裂的能力。甘精胰岛素因为B链分子结构的改变使其促有丝分裂的能力强于其他胰岛素。Ashish等[6]在观察不同胰岛素对MCF7(乳腺癌细胞)增殖的影响时得出结论,在甘精胰岛素浓度为1.5 nmol/L～1.5 mmol/L时能明显促进细胞增殖,而地特胰岛素浓度在15 nmol/L～1.5 mmol/L时促增殖作用弱于人胰岛素。Mayer等[7]实验表明含甘精胰岛素的血清对MCF7促增殖作用是含人胰岛素血清的1.11倍,而含地特胰岛素的血清为含人胰岛素血清的0.99倍,这与本文得出的结论相似 ......
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