乌司他丁对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤caspase-3表达的影响(1)
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摘要：目的观察乌司他丁对脑缺血再灌注损伤的保护作用，探讨其作用机制。方法健康雄性Wistar大鼠24只，随机分为4组，假手术组、生理盐水对照组、乌司他丁10 000 U/kg治疗组，乌司他丁50 000 U/kg治疗组。采用线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型，缺血1 h，再灌注24 h。HE染色观察大鼠脑组织的病理改变、免疫组织化学法检测脑组织caspase-3蛋白的表达、TUNEL法检测脑组织细胞凋亡数。结果乌司他丁可明显降低脑缺血再灌注中脑组织caspase-3蛋白的表达，减少脑细胞凋亡，与生理盐水对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论乌司他丁对脑缺血再灌注损伤有保护作用,可能与下调脑组织caspase-3蛋白表达，减少脑组织凋亡有关。
关键词：乌司他丁 脑缺血再灌注 caspase-3 细胞凋亡
中图分类号：R743.3R285.5文献标识码：A文章编号：1672-1349(2011)05-0580-02
乌司他丁(Ulinastatin),又称尿抑制素，是从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化得到的一种糖蛋白，是一种广谱的蛋白酶抑制剂(ulinary trypsin inhibitor,UTI)。乌司他丁具有保护脑缺血再灌注损伤的作用[1-3]。本研究采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，观察乌司他丁对大鼠脑组织caspase-3表达及细胞凋亡的影响，探讨其脑保护作用及可能的机制。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物健康雄性Wistar大鼠(山西医科大学生理实验室提供)24只，体重200 g~250 g。
1.1.2试剂与药物乌司他丁(广东天普生化医药股份有限公司，批号03091116)，规格为每瓶100 000 U;caspase-3免疫组化试剂盒、TUNEL试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2实验方法
1.2.1分组及给药方法大鼠随机分为4组，每组6只。假手术组(A组)、对照组(B组)、乌司他丁10 000 U/kg治疗组(C组)、乌司他丁50 000 U/kg治疗组(D组)。B组在制作模型后立即给予生理盐水1 mL尾静脉注射；C组、D组制作模型后分别立即给予乌司他丁10 000 U/kg、50 000 U/kg尾静脉注射，每次12 h，直至处死。
1.2.2模型制作用改良Longa 法建立大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型。大鼠造模前禁食12 h，不禁水，室温条件下称重，将大鼠用10%水合氯醛3 mL/ kg腹腔麻醉，颈正中旁开0.5 cm～1 cm切口，钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉、颈总动脉近心端，血管夹夹闭颈内动脉，在颈总动脉距离分岔口大约5 cm处用眼科剪剪开一小口，将直径约0.23 mm～0.26 mm的渔线插入，松开血管夹，以分岔口开始测量距离，插入1.8 cm～2 cm后固定渔线，缝合。缺血1 h后将线栓拉出1 cm，形成再灌注。假手术组插入1.0 cm渔线，其余步骤同实验组。待动物苏醒评估神经功能后放回笼中，自由饮食。神经功能缺陷评分按照Longa的5级4分法标准。
1.2.3标本及病理切片制备B组、C组、D组在缺血1h再灌注24 h、A组在24 h后，给予10%水合氯醛3 mL/kg麻醉，迅速开胸暴露心脏，从左心室插管至主动脉根部，在右心耳剪开一小口作出口，用生理盐水200 mL经左心室到主动脉快速冲洗血液，后用4%多聚甲醛200 mL快速灌注，断头取脑。取大鼠右侧脑组织4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水，石蜡包埋，从视交叉向后做冠状面连续切片，厚约5 μm。
1.2.4HE染色切片常规脱蜡、梯度酒精脱水、苏木素及伊红染色，梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察细胞形态。
1.2.5免疫组化测caspase-3蛋白表达切片常规脱蜡至水，3%H2O2浸泡10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3 min×3次，高压修复2 min，室温下自然冷却至常温，PBS缓冲液洗涤3 min×3次，滴加5%BSA封闭液37 ℃放置20 min，滴加一抗约100 μL，4 ℃过夜，PBS缓冲液洗涤3 min×3次，滴加二抗约100 μL，37 ℃ 30 min，PBS缓冲液洗涤3 min×3次，滴加SABC试剂，37℃放置20 min，PBS洗涤3 min×3次，滴加生物素过氧化物酶(DAB)显色，之后苏木素复染，脱水、透明，中性树胶封片，显微镜下观察caspase-3显色情况，细胞核或浆棕染为阳性。每只大鼠选取5张切片，400倍光镜下随机选取5个不重复的视野，计数其中的阳性细胞，求均值。
1.2.6TUNEL法检测细胞凋亡切片常规脱蜡至水，严格按照试剂盒步骤操作，显微镜下观察细胞凋亡情况。胞核呈棕黄色颗粒为阳性细胞。每张切片在400倍下随机选取不重叠的5个视野，计数TUNEL阳性细胞数。
1.3统计学处理采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s) 表示，采用单因素方差分析进行统计，组间比较采用Bonferroni法。
2结果
2.1HE染色结果A组神经元形态正常，胞体呈圆形，胞浆丰富，核仁清楚，无变形、水肿；B组脑组织结构疏松，有不同程度的神经细胞变性、坏死，胞体肿胀、变形，细胞周围间隙增宽，胞核深染、固缩。C组、D组神经细胞病理改变轻微，胞体轻度肿胀，偶有神经细胞变性、坏死。
2.2脑组织caspase-3蛋白表达情况Caspase-3阳性细胞呈棕黄色，显色部位为胞浆，A组caspase-3阳性细胞表达少，B组阳性细胞数较假手术组显著增加，C组、D组caspase-3阳性细胞数较生理盐水对照组明显减少(P<0.01)。详见表1。
2.3TUNEL法测细胞凋亡结果A组凋亡细胞几乎无表达，B组凋亡细胞表达较假手术组明显增加，多集中在海马区，C组、D组凋亡细胞数较对照组减少(P<0.01)。详见表1。
3讨论
脑缺血再灌注损伤后神经细胞存在着凋亡和坏死两种死亡方式。哺乳动物存在两种不同的细胞凋亡途径 ......
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