垂体腺苷酸环化酶激活肽在实验性偏头痛大鼠中的作用(1)
 |
| 第1页 |
参见附件(2488KB，3页)。
摘要：目的观察尾静脉注射垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP38)大鼠的行为学变化和三叉神经核尾部(TNC)c-fos蛋白的表达，探讨PACAP38诱导偏头痛发作的可能机制。方法将30只Wistar大鼠随机分为5组：空白对照组、硝酸甘油组、PACAP38低剂量组、PACAP 38中剂量组、PACAP38高剂量组，观察大鼠行为学变化。应用免疫组织化学染色法行脑干三叉神经脊束核尾核(TNC)部位c-fos蛋白表达变化的观察。结果PACAP38中剂量组、PACAP38高剂量组大鼠均有明显的行为学改变和c-fos蛋白免疫阳性细胞数的明显增多，各项观察指标与硝酸甘油组比较无统计学意义(P>0.05)，与空白对照组比较有统计学意义(P<0.05)。PACAP38低剂量组大鼠仅出现了耳红,出现及消失时间与硝酸甘油组比较无统计学意义(P>0.05)；但其他行为学改变均不明显，TNC部位c-fos蛋白免疫阳性细胞数与空白组比较无明显增加，与硝酸甘油组比较有统计与意义(P<0.05)。结论中等剂量(6 μg/kg)以上的PACAP38可以诱导大鼠偏头痛发作,可作为制备偏头痛大鼠模型的诱导剂。
关键词：偏头痛 垂体腺苷酸环化酶激活肽 三叉神经脊束核尾核
中图分类号：R747.2R255文献标识码：A文章编号：1672-1349(2011)05-0582-03
偏头痛是临床上常见的原发性头痛疾患，常可造成劳动力丧失。在世界卫生组织列出的世界范围内所有可造成伤残的疾病中，按危害程度偏头痛位列19位[1]。本实验通过观察尾静脉注射垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP38)后大鼠的行为学变化和大鼠三叉神经核尾核(TNC)的c-fos蛋白表达情况，与已得到公认的硝酸甘油(NTG)实验性偏头痛大鼠模型比较，探讨PACAP38能否作为诱发大鼠偏头痛发作的诱导剂，为偏头痛发病机制及治疗药物研究和开发提供实验依据。
1材料与方法
1.1实验动物Wistar系健康封闭群大鼠30只，体重(250～300)g，由山西医科大学实验动物中心提供。
1.2主要试剂及药品垂体腺苷酸环化酶激活肽(吉尔生化有限公司，批号P1009007-SY52290)，兔抗大鼠c-fos抗体、SP-9001免疫组化染色试剂盒，DAB显色剂均为博士德生物工程有限公司提供，硝酸甘油注射液(太行制药有限公司，批号120101)。
1.3方法
1.3.1分组将30只大鼠随机分为硝酸甘油模型组、PACAP38高剂量组、PACAP38中剂量组、PACAP38低剂量组、空白对照组，每组6只，雌雄各半。硝酸甘油组大鼠给予尾静脉注射硝酸甘油注射液2 μg/kg，建立实验性偏头痛大鼠模型；PACAP38高、中、低剂量组大鼠分别给予尾静脉注射PACAP38 12 μg/kg、6 μg/kg、3 μg/kg；空白对照组大鼠给予尾静脉注射1 mL/kg生理盐水。
1.3.2大鼠行为学观察观察耳红、挠头、爬笼出现及消失的时间。挠头出现时间以大鼠连续挠头次数达5次以上为标志，消失时间以一个时间段中大鼠挠头次数少于5次，并出现倦怠疲乏表现为标志。采用持续时间分段计数方法，以每30 min为一时间段。
1.3.3取材及切片造模4 h后，用10%水合氯醛0.3 mL/kg麻醉动物，仰卧固定、开胸，心尖部插管入主动脉，剪开右心耳处。首先迅速灌注生理盐水200 mL，冲净血液后再以4%多聚甲醛250 mL灌注，待充分固定后断头，取脑组织，自延髓闩部向尾端行冠状切取4 mm脑组织，放入甲醛液中固定24 h，后移入70%的乙醇中保存。常规脱水、石蜡包埋。石蜡切片机切片，每次2 μm，共4张。1.3.4免疫组化石蜡切片行常规HE染色，显微镜下观察确定组织结构未被破坏，进行免疫组织化学染色。室温显色，镜下控制反应时间，(2～3)min后显色充分。蒸馏水充分洗涤。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中型树胶封固。
1.3.5免疫组化对照实验阴性对照，用PBS缓冲液代替c-fos抗体，其他步骤与前述程序相同。
1.3.6图像定量分析在光学显微镜下，切片背景为淡黄色或无色，阳性细胞呈黄褐色圆形或卵圆形，主要为核染，易与背景分别。高倍镜下每张切片在TNC部位随机选取5个视野，记录阳性细胞数，取平均值进行统计学比较。
1.4统计学处理计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 13.0统计软件分析。各组间先行方差齐性检验，在各组方差齐的情况下，采用单因素方差分析，其中两两比较用LSD-t检验。
2结果
2.1耳红空白对照组大鼠始终没有耳红症状出现，硝酸甘油组、PACAP38高剂量组、PACAP38中剂量组、PACAP38低剂量组平均在静脉给药后4 min出现耳红，各组间无统计学意义(P>0.05);4组在给药后3 h耳红症状消失,数据记录各组间无统计学意义(P>0.05)。详见表1。
2.2挠头硝酸甘油组、PACAP38中剂量组、PACAP38高剂量组均出现了挠头增多现象，出现与消失时间基本与耳红时间相平行(P>0.05)。详见表2。大鼠在尾静脉给药后4 min出现挠头频繁，60 min～90 min维持高峰期，之后挠头次数逐渐下降，至180 min挠头消失。空白对照组、PACAP38低剂量组挠头次数无明显增加，与硝酸甘油组同时间段比较有统计学意义(P<0.05)。详见表3。
2.3爬笼硝酸甘油组、PACAP38中剂量组、PACAP38高剂量组大鼠在尾静脉给药后出现明显烦躁、爬笼次数增多，增多、减少以及高峰时间与挠头时间相类似。详见表4。2.4c-fos蛋白表达光学显微镜下可见切片背景为淡黄色，c-fos免疫反应阳性神经元呈黄褐色圆形或卵圆形，核染为主，主要分布于两侧TNC。阴性对照片无阳性信号出现。硝酸甘油组、PACAP38中剂量组、PACAP38高剂量组较空白对照组c-fos免疫阳性细胞明显增多(P<0.05)，而3组间方差分析无统计学意义(P>0.05)；PACAP38低剂量组c-fos免疫阳性细胞较空白对照组无统计学意义(P>0.05)。详见表5。
3讨论
三叉神经血管系统目前被认为是偏头痛发作的解剖结构基础，此系统的激活是患者偏头痛发作产生疼痛的关键环节 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2488KB，3页)。