高血压RAS系统相关基因治疗进展(1)
中图分类号：R544.1R255.3文献标识码：A文章编号：1672-1349(2011)05-0610-02
原发性高血压病是由遗传与环境因素相互作用而导致的多基因遗传病,遗传因素对其发病的影响占30%～50%[1]。目前有关高血压基因治疗的研究很多,肾素血管紧张素系统(RAS)是研究的热点之一。
1肾素血管紧张素系统
降低基因表达(亦称反义基因疗法)是指根据靶基因结构特点设计反义寡核苷酸(AS-ODN)分子，导入靶细胞或机体后与双链DNA或与mRNA结合形成杂合体，从而封闭或抑制升高血压相关基因的复制或表达，以期达到降压目的。RAS的过度活动是人类原发性高血压及许多高血压动物模型主要病理机制之一。目前肾素基因(REN)、血管紧张素转化酶基因(ACE)、AngⅡ1型受体(AT1R)和血管紧张素原基因(AGT)是RAS反义基因治疗的主要靶点。
1.1肾素基因(REN)Wang等[2]将反义肾素核苷酸导入冷诱导高血压(CIH)大鼠后降压幅度达40mmHg，持续至少5周，并有效抑制了整个的RAS。
1.2血管紧张素转化酶基因(ACE)Gelband 等[3]给新生自发性高血压大鼠(SHR)心内注射ACE-AS，血压降低(18±3)mmHg,且持续时间较长，其F1代大鼠也保持了这个水平。与高血压发展相关的肾血管反应性、电生理及钙离子的动态平衡均得到改善，该研究还发现虽然ACE-AS对SHR的血压下降程度不是很大，却可以永久预防肾血管的病理性改变。Wang等[4]给SHR静注逆转录病毒携带的ACE反义核苷酸，结果显著降压，并阻断了高血压引起的心、肾、血管病理改变。同时还发现ACE-AS被整合入亲代基因组传递给子代，使子一代的血压较对照组明显降低，其心肌肥厚程度也有所改善。
1.3血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)1型受体(AT1R)基因Phyills等[5]以AT1R为靶目标研究反义基因治疗的效果，向SHR的心内注射携带有AT1R的反义cDNA的白血病病毒逆转录载体(leukemia virus retroviral vector,LNSV)，可以观察到39日龄大鼠的血压显著降低。Pachori等[6]以逆转录病毒将AT1R的ASODN转染SHR,可使大鼠血压持续下降。此外,用转肾素基因大鼠建立高血压及其相关心肌肥厚动物模型,以逆转录病毒将AT1R的ASODN一次性注入新生大鼠心肌中,结果发现该ASODN能长时间持续抑制AT1R在心血管组织中(包括心脏)的表达,虽然血压未降至正常水平,但心肌肥厚程度明显减轻。Hiromichi 等[7]研究发现，AT1R基因可以使血压下降，并能逆转心肌肥厚。
1.4血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)2型受体(AT2R)基因AT2R与AT1R介导的作用相反。Metcalfe等将以慢病毒为载体的AT2R cDNA导入SHR体内，转染21周后，SHR左心室壁厚度降低，心脏肥厚程度下降[8]。由慢病毒介导的AT2R在AngⅡ灌注高血压大鼠模型中也具有抗肥厚和抗重塑作用。虽然血压持续升高但AT2R转染可以保护由高血压引起的心脏损害[9]。
1.5血管紧张素原基因(AGT)Sugano等[10]将携带有AGT mRNA反义核苷酸的重组腺相关病毒载体(rAAV-AGT-AS)一次性注入5 d龄的SHR心肌中,结果发现高血压发病推迟91 d,且大鼠在成年后血压明显降低,并持续6个月。重组腺相关病毒载体稳定,且未见肝脏毒性作用发生。但AGT-AS不能将血压完全降至正常水平，也不能完全逆转血管重塑。
2RNA干扰(RNA interference)
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来新兴的一种由双链RNA诱发的“基因沉默”现象,能高效特异地阻断靶基因的表达[11]。RNAi技术已广泛应用于抗病毒、抗肿瘤等与基因高度相关疾病的研究[12-14]。
Chen等[15]把腺病毒介导的AT，aR-shRNA注射入C57BL小鼠脑的背侧迷走神经核区域，发现夜间血压明显下降。何军华等[16]用RNAi技术下调ACE表达，观察其对SHR血压及肾脏表达ACE的影响。研究显示:Ads-EGFP-ACE-shRNA经鼠尾静脉注射后，可被主动脉、肺、心肌、肾脏组织良好吸收。SHR出现明显的血压下降，降压作用至少可持续14 d之久，降压的同时未引起心率的改变，并且这种效应来源于单次给药，较现有降压药物有明显的优势。陈闽荔等[17]观察应用RNAi技术靶向基因沉默AT1R对肾性高血压大鼠血压及组织AT1R基因表达的影响。结果发现注射rAAV-AT1R-shRNA 24 h后,收缩压较注射前明显下降(22.3±5.5) mmHg(P<0.01),最大降压幅度可达30.2 mmHg,与高血压对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),降压作用可持续7 d;实验组心脏、肾脏及主动脉AT1R的mRNA表达量明显低于高血压对照组(P<0.01)。
孙成林等[18]实验证实针对大鼠AT1R的mRNA设计的dsRNA质粒载体转染体外培养细胞,显著降低靶基因mRNA和蛋白表达,实现了基因沉默,并可以拮抗AngⅡ所诱导的体外培养血管平滑肌细胞的增殖作用。张璞等[19]发现靶向大鼠AT1R基因mRNA的短发夹RNA腺病毒载体,在体外和体内环境下高效特异性抑制靶基因的表达,能达到基因干扰目的。
张敬群等[20]以高肾素型高血压模型Goldblatt两肾一夹肾血管性高血压大鼠模型为研究对象,用构建的RNAi质粒pAT1a-shRNA1或pAT1a-shRNA2单次尾静脉注射,不仅阻断了进行性的血压升高趋势,并有一定程度下降,有统计学意义。研究还发现,RNAi质粒能显著抑制肾血管性高血压导致的心肌肥厚、重构，血管壁的重构硬化得到显著改善。
3问题与展望
高血压的基因治疗取得了令人瞩目的成就，有着令人鼓舞的前景，但是目前高血压病的基因疗法尚处于动物实验阶段,尚未达到广泛应用于临床这一既定目标，有许多问题仍然需要克服和解决。如靶基因的界定，基因转录的高效性、安全性、长效性问题、定向表达问题、给药途径问题、单一基因转移为主的基因疗法到多基因多因素多环节整体调节等。
但是随着分子生物学技术迅猛发展，深入了解血压及高血压相关基因对血压的调控机制，阐明人体组织器官生物学特性和疾病发展的病理生理过程，明确动物实验和临床研究的差距，相信基因治疗能成为高血压病治疗的最佳有效途径之一。
1)为天津市科委重点基金课题(No.09JCZDJC20600)，课题名：中药干预肝阳上亢型高血压不同模型物质基础变化的机理
参考文献：
[1]Tanira MO,Al Balushi KA.Genetic variations related to hyperten-sion:A review[J].J Hum Hypertens,2005,19:7-19., 百拇医药(汪涛 赵英强 徐强 周巍)
原发性高血压病是由遗传与环境因素相互作用而导致的多基因遗传病,遗传因素对其发病的影响占30%～50%[1]。目前有关高血压基因治疗的研究很多,肾素血管紧张素系统(RAS)是研究的热点之一。
1肾素血管紧张素系统
降低基因表达(亦称反义基因疗法)是指根据靶基因结构特点设计反义寡核苷酸(AS-ODN)分子，导入靶细胞或机体后与双链DNA或与mRNA结合形成杂合体，从而封闭或抑制升高血压相关基因的复制或表达，以期达到降压目的。RAS的过度活动是人类原发性高血压及许多高血压动物模型主要病理机制之一。目前肾素基因(REN)、血管紧张素转化酶基因(ACE)、AngⅡ1型受体(AT1R)和血管紧张素原基因(AGT)是RAS反义基因治疗的主要靶点。
1.1肾素基因(REN)Wang等[2]将反义肾素核苷酸导入冷诱导高血压(CIH)大鼠后降压幅度达40mmHg，持续至少5周，并有效抑制了整个的RAS。
1.2血管紧张素转化酶基因(ACE)Gelband 等[3]给新生自发性高血压大鼠(SHR)心内注射ACE-AS，血压降低(18±3)mmHg,且持续时间较长，其F1代大鼠也保持了这个水平。与高血压发展相关的肾血管反应性、电生理及钙离子的动态平衡均得到改善，该研究还发现虽然ACE-AS对SHR的血压下降程度不是很大，却可以永久预防肾血管的病理性改变。Wang等[4]给SHR静注逆转录病毒携带的ACE反义核苷酸，结果显著降压，并阻断了高血压引起的心、肾、血管病理改变。同时还发现ACE-AS被整合入亲代基因组传递给子代，使子一代的血压较对照组明显降低，其心肌肥厚程度也有所改善。
1.3血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)1型受体(AT1R)基因Phyills等[5]以AT1R为靶目标研究反义基因治疗的效果，向SHR的心内注射携带有AT1R的反义cDNA的白血病病毒逆转录载体(leukemia virus retroviral vector,LNSV)，可以观察到39日龄大鼠的血压显著降低。Pachori等[6]以逆转录病毒将AT1R的ASODN转染SHR,可使大鼠血压持续下降。此外,用转肾素基因大鼠建立高血压及其相关心肌肥厚动物模型,以逆转录病毒将AT1R的ASODN一次性注入新生大鼠心肌中,结果发现该ASODN能长时间持续抑制AT1R在心血管组织中(包括心脏)的表达,虽然血压未降至正常水平,但心肌肥厚程度明显减轻。Hiromichi 等[7]研究发现，AT1R基因可以使血压下降，并能逆转心肌肥厚。
1.4血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)2型受体(AT2R)基因AT2R与AT1R介导的作用相反。Metcalfe等将以慢病毒为载体的AT2R cDNA导入SHR体内，转染21周后，SHR左心室壁厚度降低，心脏肥厚程度下降[8]。由慢病毒介导的AT2R在AngⅡ灌注高血压大鼠模型中也具有抗肥厚和抗重塑作用。虽然血压持续升高但AT2R转染可以保护由高血压引起的心脏损害[9]。
1.5血管紧张素原基因(AGT)Sugano等[10]将携带有AGT mRNA反义核苷酸的重组腺相关病毒载体(rAAV-AGT-AS)一次性注入5 d龄的SHR心肌中,结果发现高血压发病推迟91 d,且大鼠在成年后血压明显降低,并持续6个月。重组腺相关病毒载体稳定,且未见肝脏毒性作用发生。但AGT-AS不能将血压完全降至正常水平，也不能完全逆转血管重塑。
2RNA干扰(RNA interference)
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来新兴的一种由双链RNA诱发的“基因沉默”现象,能高效特异地阻断靶基因的表达[11]。RNAi技术已广泛应用于抗病毒、抗肿瘤等与基因高度相关疾病的研究[12-14]。
Chen等[15]把腺病毒介导的AT，aR-shRNA注射入C57BL小鼠脑的背侧迷走神经核区域，发现夜间血压明显下降。何军华等[16]用RNAi技术下调ACE表达，观察其对SHR血压及肾脏表达ACE的影响。研究显示:Ads-EGFP-ACE-shRNA经鼠尾静脉注射后，可被主动脉、肺、心肌、肾脏组织良好吸收。SHR出现明显的血压下降，降压作用至少可持续14 d之久，降压的同时未引起心率的改变，并且这种效应来源于单次给药，较现有降压药物有明显的优势。陈闽荔等[17]观察应用RNAi技术靶向基因沉默AT1R对肾性高血压大鼠血压及组织AT1R基因表达的影响。结果发现注射rAAV-AT1R-shRNA 24 h后,收缩压较注射前明显下降(22.3±5.5) mmHg(P<0.01),最大降压幅度可达30.2 mmHg,与高血压对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),降压作用可持续7 d;实验组心脏、肾脏及主动脉AT1R的mRNA表达量明显低于高血压对照组(P<0.01)。
孙成林等[18]实验证实针对大鼠AT1R的mRNA设计的dsRNA质粒载体转染体外培养细胞,显著降低靶基因mRNA和蛋白表达,实现了基因沉默,并可以拮抗AngⅡ所诱导的体外培养血管平滑肌细胞的增殖作用。张璞等[19]发现靶向大鼠AT1R基因mRNA的短发夹RNA腺病毒载体,在体外和体内环境下高效特异性抑制靶基因的表达,能达到基因干扰目的。
张敬群等[20]以高肾素型高血压模型Goldblatt两肾一夹肾血管性高血压大鼠模型为研究对象,用构建的RNAi质粒pAT1a-shRNA1或pAT1a-shRNA2单次尾静脉注射,不仅阻断了进行性的血压升高趋势,并有一定程度下降,有统计学意义。研究还发现,RNAi质粒能显著抑制肾血管性高血压导致的心肌肥厚、重构，血管壁的重构硬化得到显著改善。
3问题与展望
高血压的基因治疗取得了令人瞩目的成就，有着令人鼓舞的前景，但是目前高血压病的基因疗法尚处于动物实验阶段,尚未达到广泛应用于临床这一既定目标，有许多问题仍然需要克服和解决。如靶基因的界定，基因转录的高效性、安全性、长效性问题、定向表达问题、给药途径问题、单一基因转移为主的基因疗法到多基因多因素多环节整体调节等。
但是随着分子生物学技术迅猛发展，深入了解血压及高血压相关基因对血压的调控机制，阐明人体组织器官生物学特性和疾病发展的病理生理过程，明确动物实验和临床研究的差距，相信基因治疗能成为高血压病治疗的最佳有效途径之一。
1)为天津市科委重点基金课题(No.09JCZDJC20600)，课题名：中药干预肝阳上亢型高血压不同模型物质基础变化的机理
参考文献：
[1]Tanira MO,Al Balushi KA.Genetic variations related to hyperten-sion:A review[J].J Hum Hypertens,2005,19:7-19., 百拇医药(汪涛 赵英强 徐强 周巍)