地黄饮子对Aβ诱导的PC12细胞SODmRNA表达影响的研究(2)
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表1 引物序列以及引物特异性介导扩增的PCR产物大小
1.2.4.4 结果分析 每个样本作2个复孔，实验重复5次。反应结束后，使用Sequence Detection software version 1.2.3软件(Applied Biosystems公司)分析PCR过程各检测样本的CT(Threshold cycle)值。CT值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。本研究通过2【sup】-△△CT【/sup】计算SOD相对mRNA表达水平，△CT【sub】【/sub】interventionCT【sub】【/sub】intervention SOD-CT【sub】【/sub】intervention GAPDH，△CT【sub】blank【/sub】CT【sub】【/sub】blank SOD-CT【sub】【/sub】blank GAPDH，△△CT△CT【sub】【/sub】intervention-△CT【sub】blank【/sub】，SOD mRNA表达差别倍数以2【sup】-△△CT【/sup】表示。由熔解曲线判断PCR反应的特异性。
1.3 统计学处理 数据用均数±标准差(x±s)表示，数据统计分析均在SPSS11.0软件中进行，采用方差分析，多组间两两比较用LSD法。
2 结 果
2.1 产物鉴定 SOD、GAPDH的熔解曲线中均有单一的主峰，熔解温度分别为82.0 ℃和86.7 ℃，相同扩增条件下重复多次，得到的 SOD、GAPDH熔解温度均分别在82.0 ℃、86.7 ℃左右，上下不超过 1 ℃，说明所扩增的为特异性产物(见图1、图2)。扩增产物经2%琼脂糖电泳，紫外线下扫描分析，符合设计的片断长度(见图3)。
图1 PC12细胞 SOD荧光定量 PCR 熔解曲线
图2 PC12细胞 GAPDH荧光定量 PCR 熔解曲线
图3 荧光定量PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
2.2.2 【sup】-△△CT【/sup】法可行性分析 要使2【sup】-△△CT【/sup】法计算方法有效，目的基因与管家基因的扩增效率必须相等。对不同稀释度模板分别进行目的基因和管家基因扩增，得出一条以模板稀释度的对数值为横坐标，以△CT为纵坐标的直线，如果该线的斜率接近于0，说明在反应体系中，目的基因与管家基因的扩增效率接近，也就是说，可以使用2【sup】-△△CT【/sup】法作为相对定量的分析方法。本研究中，浓度梯度线的斜率为0.0532(Y0.053 2logX+1.981)，并且目的基因与管家基因扩增曲线平行，说明可使用2【sup】-△△CT【/sup】方法对目的基因进行相对定量。
2.3 地黄饮子对PC12细胞SODmRNA表达的影响(见表4、图4) 与空白组(差别倍数为2【sup】0【/sup】1)比较，模型组相对定量基因表达升高(P<0.01)，地黄饮子含药脑脊液可升高AD模型细胞SODmRNA的表达(P<0.05或P<0.01)，中药低、中剂量组与安理申组比较差异无统计学意义，中高组与安理申组比较有统计学意义(P<0.05)。
表4 各组细胞SODmRNA表达比较(x±s)
图4 PC12细胞 SOD荧光定量 PCR 扩增曲线
3 讨 论
AD的病位在脑，其病机以本虚标实为特征。本虚主要在于肾精不足，髓海亏虚，清阳不升【sup】[4]【/sup】。人至老年，肾虚精不生髓，髓海空虚则脑神失用，神衰智力失聪终致痴呆。所以说随年龄的增长而发生的肾虚精亏、髓海不足是AD发生的最基本的病机；标实在于痰浊、瘀血蒙蔽脑窍，闭阻脑络。一方面肾虚为主的五脏虚衰可导致痰浊的产生，此所谓因虚而致实；另一方面，痰浊为患又可影响气血津液的化生和运行，致本虚更甚，即因实而致虚。两者互为因果，形成恶性循环，以致病程缠绵，见症多端。故诸多医家认为随年龄的增长而发生的肾精亏虚为主的五脏虚衰是AD发生的内在机制，兼挟痰瘀是加速衰老导致老年性痴呆发生的重要因素。
地黄饮子出自刘完素的《黄帝素问宣明论方》，具有“滋肾阴、补肾阳、开窍化痰”之功，本方符合AD本虚标实的病机特点。临床报道该方治疗中风、脑萎缩、血管性痴呆、运动神经元病等脑病有较好的疗效，对神经系统具有较好的保护作用。我们前期的研究表明，地黄饮子对多种AD模型大鼠的学习记忆功能、胆碱能系统、氧化反应、细胞凋亡、神经元的炎症损伤、脑组织能量代谢等方面均有明显作用，体现了该方防治AD的良好前景。
由于中药复方原有成分在体内或转化成活性成分，或代谢后失活，或没有被机体吸收，或通过诱导机体内源性成分间接起作用，这使得中药复方的研究趋于困难。但由于化学成分或生物活性成分通过血脑屏障的数量有限，脑脊液药理学的方法则可以简化这种研究过程。脑脊液药理学排除了体外实验的各种干扰因素，既可反映出中药复方及其代谢产物的药理作用，又可反映出药物诱导机体产生的内源性成分的作用，较接近药物在体内的生物转化的真实过程，更具有科学性、真实性【sup】[5]【/sup】。脑脊液药理学还解决了中药大分子能否通过血脑屏障的问题，为探讨中药复方对中枢神经系统的作用提供了一条不可替代的途径。
β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)的沉积在阿尔茨海默病发病上起关键作用【sup】[6]【/sup】,纤维状沉积的Aβ是SP的主要成分，是AD的重要病理学特征，也是各种原因诱发AD的共同通路，在AD的发生、发展中起着关键作用【sup】[7]【/sup】。氧化应激是实现Aβ神经毒性的途径之一，而氧自由基能促进Aβ的聚积,使其在脑内过度活跃,导致神经元退行性变而发生AD。SOD是机体内天然的氧自由基清除剂，是一种含金属抗氧化酶，是清除自由基酶系统中的较重要的酶类，SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要作用，是衡量机体抗氧化能力的重要标志酶。
本研究结果表明，地黄饮子能提高Aβ诱导的PC12细胞SODmRNA的表达，提高抗氧化能力，较好地拮抗自由基损伤，从而起到防治AD的作用。
参考文献：
[1] 陈民,王晶,陈欢雪.Aβ1-42合并IBO诱导阿尔茨海默病大鼠模型的建立和评价[J].中西医结合心脑血管病杂志,2010,8(4):465-467.
[2] 周妍妍，谢宁，姚辛敏，等.地黄饮子对β淀粉样蛋白所致PC12细胞损伤的保护作用[J] ......
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