RNA干扰靶向XIAP对人脑胶质瘤细胞U251的生物学行为影响(2)
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2.1 siRNA转染脑胶质瘤U251细胞的转染效率 计算出转染效率在80%以上。
2.2 siRNA抑制 XIAP后mRNA的表达(见图1) 共3个靶位的siRNA， siRNA2特异性抑制 XIAP的表达，而其他两个靶位siRNA没有明显的抑制效果。
注：M为脂质体2000 DNA mark1～3 为siRNA1-34为阳性对照。
图1 RT-PCR检测3个靶位siRNA的特异性
2.3 siRNA抑制 XIAP前后的蛋白表达(见图2) 内参显示为均一的条带，实验组XIAP组蛋白灰度比值有较大的差异，以30 nmol/L最为显著，蛋白表达量较多，而转染前XIAP的蛋白表达几乎很少，与内参对照比较各组的灰度值比值为12%、86%、71%、5.5%、73%、68%，各组XIAP蛋白的表达量由0.088±0.005上升到0.705±0.040(P<0.05)。表明siRNA抑制了XIAP基因，使XIAP低表达，甚至不表达。
注：1为阳性对照组；2为阴性对照组；3为20 nmol/L组，4 为30 nmol/L组；5为50 nmol/L组；6为转染前。
图2 转染前后脑胶质瘤U251细胞XIAP的表达
2.4 siRNA抑制DNMT1前后细胞周期和凋亡的比较(见表1) 人脑胶质瘤细胞U251经siRNA干扰后停滞在G1期的细胞增多，与转染前及阴性对照组比较有统计学意义(P<0.05)，三个浓度梯度的siRNA,以30 nmol/L最为显著。与阴性对照组及转染前比较，细胞凋亡率增加(P<0.05)，以30 nmol/L最为显著。表1 siRNA干扰后细胞周期和凋亡率的比较(x±s)%
3 讨 论
RNA干扰是指21-23nt的siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子，导致mRNA降解，只有在特异性双链核糖核酸(dsRNA)存在的条件下mRNA才被降解，从而实现特定基因的表达沉默；RNA干扰技术能同时封闭多个基因或基因家族；RNAi技术使基因表达暂时降低，基因组的信息仍是完整的，优越于基因敲降技术(可能破坏基因的完整性)；同时RNAi技术因其操作简单、特异性高、能迅速而方便地使某个基因失去功能；鉴于以上优点RANi技术首先被应用于功能基因组和反向遗传学的研究，其次用于研究mRNA差别剪接形成的异构体【sup】[2-4]【/sup】。
XIAP家族成员的表达增高是引起肿瘤细胞逃逸各种凋亡途径(内源性的线粒体途径和外源性的死亡受体途径)的诱导因素的主要原因【sup】[5]【/sup】，XIAP是抑制蛋白家族中抗凋亡作用最强的一个成分，在细胞畸变、肿瘤形成时表达明显增加【sup】[6]【/sup】，同时有研究证明XIAP的高表达与放疗、化疗的抵抗性呈正相关【sup】[7]【/sup】，XIAP蛋白水平的变化能够明显改善细胞的凋亡反应。
本实验采用RNA干扰技术，通过脂质体2000成功地将siRNA转入人脑胶质瘤U251细胞，在荧光显微镜下观察转染后带荧光的细胞，转染效率在80%以上，肯定了后继实验的可靠性；采用PCR检测siRNA干扰后XIAP的mRNA表达，结果显示siRNA2效果显著，使XIAP低表达，甚至不表达；采用Western-blot检测不同浓度siRNA干扰后XIAP蛋白的表达显示：30 nmol/L siRNA抑制效率较强；采用流式细胞仪检测发现经RNA干扰后停滞在G0/G1期的细胞增多，在S期的细胞减少，并且细胞的凋亡率增加；同时，本研究还发现高浓度的siRNA并不能带来更高的抑制效应，甚至有抑制效应下降的现象，主要的原因可能与RNAi发生时引起的一些非特异性反应及剂量效应的缺失有关，并且一些学者发现当siRNA浓度增高时有基因表达上调的现象【sup】[8]【/sup】。结合本实验结果认为，RNAi技术可抑制脑胶质瘤细胞U251上XIAP基因的表达，人工合成siRNA可通过抑制脑胶质瘤细胞的增殖和促进凋亡而发挥抗肿瘤作用。因此特异性siRNA干扰XIAP基因可能为人脑胶质瘤治疗提供广阔的应用前景。
参考文献：
[1] Tfelt-Hansen J,Kanuparthi D,Chattopadhyay N.The emerging role of pituitary tumor transforming gene in tumor genesis[J].Clinic Med Press,2006,4(2):130-137.
[2] Chow LS,LoK W,Kwong J,et al.RASSFIA is a target tumor suppressor from 3p21.3 in nasopharyngeal carcinoma[J].Cancer,2004,109(6):839-847.
[3] Dreijerink K,Braga E,Kuzmin I,et al.The candidate tumor suppressor geneRASS1A from human chromosome 3p21.3 are involved in kidney tumor genesis[J] ......
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