益肾活血胶囊对高同型半胱氨酸血症及动脉粥样硬化兔TGF-β1mRNA和蛋白表达的影响(2)
参见附件(12kb)。
1.3.2 血浆Hcy测定 实验结束时每只动物采血2 mL，EDTA-Na2 抗凝，30 min 内4 ℃3 000 r/ min离心15 min，分离血浆，-80 ℃冻存，以高效液相色谱法检测血浆Hcy浓度。
1.3.3 腹主动脉形态学观察 末次给药后24 h禁食，不禁水，3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉。快速打开腹腔剥离腹主动脉，剪取约0.5 cm腹主动脉，10%中性甲醛固定，苏木素-伊红染色。用Image-Pro Plus 5.0图像分析系统检测管壁平均内膜厚度(IT)、中膜厚度(MT)、内膜面积(IA)、内膜与中膜面积比(IA/MA)。
1.3.4 总RNA提取及cDNA 合成 取约1 cm 冻存的腹主动脉，按Trizol 试剂说明书提取组织总RNA，用紫外分光光度仪测OD260/ OD280，所有标本值在1.7～2.0。用Oligo dT、dNTP 和M-MLV 在PCR热循环仪上将RNA 反转录为cDNA ，反应条件为42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。
1.3.5 实时荧光定量PCR检测TGF-β1mRNA表达 兔TGF-β1与内参基因GAPDH 引物由上海博亚公司(BioAsia ) 合成,引物序列为:TGF-β1(132 bp) 上游5'- GACCTGGGCTGGAAGTGG -3'，下游5'- CGGGTTGTGCTGGTTGTA -3 ';GAPDH(180bp)，上游5'- CATCATCCCTGCCTCCACT-3'，下游5'- GCCTGCTTCACCACCTTCTT-3'。反应体系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL,SYBR Green I 10 μL，加水至20 μL。反应条件： 95 ℃预变性10 s ；59.5 ℃(TGF-β1) 或64 ℃(GAPDH) 退火5 s；72 ℃延伸10 s，共45个循环，最后40 ℃ 30 s结束反应。采用2-ΔΔCt方法对TGF-β1 mRNA 表达进行相对定量分析。
1.3.6 免疫组化检测腹主动脉壁TGF-β1蛋白表达 3%H2O2室温孵育10min，PBS洗2 min×3次。滴加10%正常羊血清封闭液，室温孵育20 min，甩干。滴加兔抗人、TGF-β1多克隆抗体(1∶50稀释)。滴加生物素化山羊抗兔IgG。DAB 镜下显色，以PBS 代替一抗做阴性对照。
1.3.7 统计学处理 实验数据以均数±标准差(x±s)表示，组间差异采用one-way ANOVA分析和检验。采用SPSS 10.0 进行统计处理。
2 结 果
2.1 血浆Hcy 浓度变化(见表1) 与正常组相比，模型组兔血浆Hcy浓度明显升高(P<0.01) 。经中药益肾活血胶囊及西药叶酸、维生素B6、维生素B12治疗，Hcy浓度均明显降低，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.01)。中药大剂量组血浆Hcy水平低于西药组(P<0.01)。
表1 各实验组兔血浆Hcy浓度比较(x±s)μmol/L
2.2 腹主动脉形态学指标比较(见表2) 与正常组相比，模型组兔腹主动脉IT、IA、IA/MA均明显增加(P<0.01)；与模型组相比 ......
1.3.2 血浆Hcy测定 实验结束时每只动物采血2 mL，EDTA-Na2 抗凝，30 min 内4 ℃3 000 r/ min离心15 min，分离血浆，-80 ℃冻存，以高效液相色谱法检测血浆Hcy浓度。
1.3.3 腹主动脉形态学观察 末次给药后24 h禁食，不禁水，3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉。快速打开腹腔剥离腹主动脉，剪取约0.5 cm腹主动脉，10%中性甲醛固定，苏木素-伊红染色。用Image-Pro Plus 5.0图像分析系统检测管壁平均内膜厚度(IT)、中膜厚度(MT)、内膜面积(IA)、内膜与中膜面积比(IA/MA)。
1.3.4 总RNA提取及cDNA 合成 取约1 cm 冻存的腹主动脉，按Trizol 试剂说明书提取组织总RNA，用紫外分光光度仪测OD260/ OD280，所有标本值在1.7～2.0。用Oligo dT、dNTP 和M-MLV 在PCR热循环仪上将RNA 反转录为cDNA ，反应条件为42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。
1.3.5 实时荧光定量PCR检测TGF-β1mRNA表达 兔TGF-β1与内参基因GAPDH 引物由上海博亚公司(BioAsia ) 合成,引物序列为:TGF-β1(132 bp) 上游5'- GACCTGGGCTGGAAGTGG -3'，下游5'- CGGGTTGTGCTGGTTGTA -3 ';GAPDH(180bp)，上游5'- CATCATCCCTGCCTCCACT-3'，下游5'- GCCTGCTTCACCACCTTCTT-3'。反应体系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL,SYBR Green I 10 μL，加水至20 μL。反应条件： 95 ℃预变性10 s ；59.5 ℃(TGF-β1) 或64 ℃(GAPDH) 退火5 s；72 ℃延伸10 s，共45个循环，最后40 ℃ 30 s结束反应。采用2-ΔΔCt方法对TGF-β1 mRNA 表达进行相对定量分析。
1.3.6 免疫组化检测腹主动脉壁TGF-β1蛋白表达 3%H2O2室温孵育10min，PBS洗2 min×3次。滴加10%正常羊血清封闭液，室温孵育20 min，甩干。滴加兔抗人、TGF-β1多克隆抗体(1∶50稀释)。滴加生物素化山羊抗兔IgG。DAB 镜下显色，以PBS 代替一抗做阴性对照。
1.3.7 统计学处理 实验数据以均数±标准差(x±s)表示，组间差异采用one-way ANOVA分析和检验。采用SPSS 10.0 进行统计处理。
2 结 果
2.1 血浆Hcy 浓度变化(见表1) 与正常组相比，模型组兔血浆Hcy浓度明显升高(P<0.01) 。经中药益肾活血胶囊及西药叶酸、维生素B6、维生素B12治疗，Hcy浓度均明显降低，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.01)。中药大剂量组血浆Hcy水平低于西药组(P<0.01)。
表1 各实验组兔血浆Hcy浓度比较(x±s)μmol/L
2.2 腹主动脉形态学指标比较(见表2) 与正常组相比，模型组兔腹主动脉IT、IA、IA/MA均明显增加(P<0.01)；与模型组相比 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(12kb)。