清开灵对缺氧体外血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1表达的影响(2)
参见附件(12kb)。
1.6 荧光实时定量PCR反应
1.6.1 总RNA提取 采用SV总RNA纯化系统试剂盒提取总RNA，在紫外分光光度计中测OD260、OD280值，计算RNA浓度和含量。采用反转录系统试剂盒进行mRNA反转录反应。
1.6.2 引物合成 通过检索NCBI获得小鼠ZO-1 mRNA基因序列，引物交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司设计并合成。ZO-1:Forward 5' -AGGACACCAAAGCATGTGAG-3',Reverse 5'- GGCATTCCTGCTGGTTACA-3'，扩增片段长度86 bp；内参β-actin:5'- AGG CCA ACC GTG AAA AGA TG -3'，Reverse 5'- TGG CGT GAG GGA GAG CAT AG -3'，扩增片段长度185bp。
1.6.3 荧光实时定量PCR反应 反应体系及反应条件：总反应体系25 μL，2 mix 12.5 UL，无RNA酶水5.5 UL，cDNA 5 UL，上游引物1 UL(10 μmol/L)，下游引物1 UL(10 μmol/L)，反应条件：95 ℃ 10 min预变性；然后95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循环。反应结束计算机自动计算CT值。 扩增效率标准曲线、熔解曲线和扩增曲线：每个引物均把CDNA按倍比稀释5次。观察熔解曲线和扩增曲线。
1.7 统计学处理 计量资料以均数±标准差(x±s)表示，用SPSS17.0软件分析。组间比较用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 标准曲线、熔解曲线和扩增曲线 求得标准曲线，基因扩增效率(Eff)95.2%，相关系数(Rsq)＝0.999，可见引物的Eff在(100±10)%，Rsq>0.98，呈良好的线性关系，定量结果准确可靠。各组目的基因PCR产物的扩增曲线平滑，有明显的指数扩增期；熔解曲线为单特异峰，Tm值均>80℃，说明没有引物二聚体及非特异性扩增产物。
2.2 荧光实时定量ZO-1基因转录量 CT值表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，根据2-△△CT法求出初始cDNA的相对量。模型组ZO-1基因转录量显著低于正常对照组(P<0.01)；清开灵中、高剂量组和尼莫地平组能明显升高缺氧复氧后微血管内皮细胞ZO-1的基因转录，(较模型组)(P<0.01)。详见表1。
表1 各组ZO-1基因转录量(x±s)
2.3 ZO-1蛋白表达量 与正常对照相比，模型组 ZO-1表达量降低78.90%，表明缺氧损伤能显著抑制细胞ZO-1蛋白的表达(P<0.05)。与模型组相比，低、中、高剂量清开灵分别使ZO-1的表达量提高3.635倍(或363.51%)、5.554倍(或555.40%)和7.919倍(或791.89%)，清开灵可显著提高缺氧损伤后细胞ZO-1蛋白的表达(P<0.05)。清开灵高剂量组增加ZO-1蛋白的表达非常显著，甚至超过正常组该蛋白的表达水平(P<0.01)。详见表2。
表2 ZO-1蛋白表达量(x±s)
3 讨 论
缺血性脑中风会首先损伤大脑的BBB，使其结构和功能发生改变，造成BBB的屏障功能下降，通透性增加[6]。Preston[7]等通过计算BBB对大分子示踪剂和水分子示踪剂通透性的转运常数发现，大鼠短暂性脑缺血再灌注后BBB通透性的增加主要是由TJ开放导致，而并非是胞饮转运增强，脑微血管内皮细胞的TJ闭锁小带长度随着再灌注时间延长逐渐减少。
脑微血管内皮细胞间的TJ是BBB 最主要的物质结构基础，它能够封闭内皮细胞顶部的细胞间隙 ......
1.6 荧光实时定量PCR反应
1.6.1 总RNA提取 采用SV总RNA纯化系统试剂盒提取总RNA，在紫外分光光度计中测OD260、OD280值，计算RNA浓度和含量。采用反转录系统试剂盒进行mRNA反转录反应。
1.6.2 引物合成 通过检索NCBI获得小鼠ZO-1 mRNA基因序列，引物交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司设计并合成。ZO-1:Forward 5' -AGGACACCAAAGCATGTGAG-3',Reverse 5'- GGCATTCCTGCTGGTTACA-3'，扩增片段长度86 bp；内参β-actin:5'- AGG CCA ACC GTG AAA AGA TG -3'，Reverse 5'- TGG CGT GAG GGA GAG CAT AG -3'，扩增片段长度185bp。
1.6.3 荧光实时定量PCR反应 反应体系及反应条件：总反应体系25 μL，2 mix 12.5 UL，无RNA酶水5.5 UL，cDNA 5 UL，上游引物1 UL(10 μmol/L)，下游引物1 UL(10 μmol/L)，反应条件：95 ℃ 10 min预变性；然后95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循环。反应结束计算机自动计算CT值。 扩增效率标准曲线、熔解曲线和扩增曲线：每个引物均把CDNA按倍比稀释5次。观察熔解曲线和扩增曲线。
1.7 统计学处理 计量资料以均数±标准差(x±s)表示，用SPSS17.0软件分析。组间比较用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 标准曲线、熔解曲线和扩增曲线 求得标准曲线，基因扩增效率(Eff)95.2%，相关系数(Rsq)＝0.999，可见引物的Eff在(100±10)%，Rsq>0.98，呈良好的线性关系，定量结果准确可靠。各组目的基因PCR产物的扩增曲线平滑，有明显的指数扩增期；熔解曲线为单特异峰，Tm值均>80℃，说明没有引物二聚体及非特异性扩增产物。
2.2 荧光实时定量ZO-1基因转录量 CT值表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，根据2-△△CT法求出初始cDNA的相对量。模型组ZO-1基因转录量显著低于正常对照组(P<0.01)；清开灵中、高剂量组和尼莫地平组能明显升高缺氧复氧后微血管内皮细胞ZO-1的基因转录，(较模型组)(P<0.01)。详见表1。
表1 各组ZO-1基因转录量(x±s)
2.3 ZO-1蛋白表达量 与正常对照相比，模型组 ZO-1表达量降低78.90%，表明缺氧损伤能显著抑制细胞ZO-1蛋白的表达(P<0.05)。与模型组相比，低、中、高剂量清开灵分别使ZO-1的表达量提高3.635倍(或363.51%)、5.554倍(或555.40%)和7.919倍(或791.89%)，清开灵可显著提高缺氧损伤后细胞ZO-1蛋白的表达(P<0.05)。清开灵高剂量组增加ZO-1蛋白的表达非常显著，甚至超过正常组该蛋白的表达水平(P<0.01)。详见表2。
表2 ZO-1蛋白表达量(x±s)
3 讨 论
缺血性脑中风会首先损伤大脑的BBB，使其结构和功能发生改变，造成BBB的屏障功能下降，通透性增加[6]。Preston[7]等通过计算BBB对大分子示踪剂和水分子示踪剂通透性的转运常数发现，大鼠短暂性脑缺血再灌注后BBB通透性的增加主要是由TJ开放导致，而并非是胞饮转运增强，脑微血管内皮细胞的TJ闭锁小带长度随着再灌注时间延长逐渐减少。
脑微血管内皮细胞间的TJ是BBB 最主要的物质结构基础，它能够封闭内皮细胞顶部的细胞间隙 ......
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