大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区神经元凋亡机制的研究(1)
参见附件(12kb)。
摘要：目的 研究大鼠全脑短暂缺血再灌注后海马CA1区椎体神经元的死亡机制。方法采用经典的四血管夹闭法制作大鼠全脑缺血再灌注模型，取缺血再灌注后不同时间(6 h、24 h、48 h)的海马CA1区脑组织，用ELISA检测Caspase-3的活性变化。同时运用免疫印记方法检测PKC、NMDA受体NR2A及NR2B亚基磷酸化水平的变化。结果 与对照组相比，Caspase-3检测显示缺血再灌注6 h、24 h、48 h海马CA1区椎体神经元呈现逐渐凋亡增多的迟发性死亡。磷酸化蛋白激酶C在缺血6 h即有明显增高，并且于24 h、48 h达到表达高峰(P<0.05)；NMDA受体亚基NR2A和R2B的磷酸化水平缺血再灌注后均呈现明显升高趋势。讨论 PKC、NR2B、CaMⅡ级联反应的发生可能是大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区锥体神经元发生迟发性死亡的重要机制。
关键词：脑缺血再灌注；NMDA受体；神经元；凋亡；大鼠
中图分类号：R743.31 R258.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2011)07-0848-03
目前对缺血后脑损伤的机制尚未阐明，临床上也无理想的治疗手段[1,2]。海马CA1区锥体神经元对于缺血性损伤特别敏感。在缺血再灌注过程发生过程中，如果缺血过程较为短暂，则细胞死亡主要表现为迟发性的神经元死亡，即凋亡[3,4]。NMDA受体过度激活或不受调控的活化已经被证实牵涉在诸如脑中风、脑创伤等许多急慢性中枢神经系统病症中，并介导了兴奋毒性神经元死亡[5-11]。NMDA受体特异性拮抗剂的使用，发挥了不同程度的缺血再灌注后保护作用蛋白激酶C，属于丝氨酸/苏氨酸激酶的家族成员，在记忆的形成、诱导LTP和突触囊泡的释放中发挥着关键性的作[12]。用[13]。NMDA受体是PKC的潜在作用靶点，PKC可以使NR1、NR2B、NR2B等NMDA受体亚基发生磷酸化而活化[14,15]。钙调节蛋白酶Ⅱ(Calmodulin,CaMⅡ在神经元损伤继而发生的钙离子大量内流中发挥着重要作用，其与NMDA受体亚基NR2B亚基形成的复合物在神经元损伤中发挥着重要的作用。本研究旨在研究大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区NMDA受体NR1、NR2A、NR2B亚基的磷酸化水平变化及其与神经元死亡之间的关系，探索这种表达变化可能的上游调控因子。
1 材料与方法
1.1 动物模型制备 雄性Wistar大鼠50只(体重180 g～250 g)，由山西医科大学实验动物中心提供。采用改良Pulsinelli四血管夹闭方法进行短暂前脑缺血。大鼠存活6 h、24 h或48 h后进行相关实验。
1.2 Caspase-3活性检测 用酶标法测定脑组织裂解物中Caspase-3的活性，蛋白含量标准化校正后的OD 值：以正常组的活性为1，计算其余各组的相对活性。
1.3 Western-Blot检测 大鼠在短暂性全脑缺血15 min后再灌注，在缺血再灌注后不同时间点(6 h、24 h、48 h)断头取脑，分离出海马，并迅速在解剖显微镜下将海马CA1区组织分离出来。提取脑组织细胞膜蛋白样品。聚丙烯酰胺凝胶变性电泳(SDS-PAGE)及蛋白印迹完毕后，抗体按照1∶1 000稀释，β-actin作为内参。经KODAK IS440自显影系统进行曝光显影，使用KODAK MI软件进行吸光度值测定分析。
1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0 统计软件分析。数据以均数±标准差(x±s)表示，成组设计的多个样本均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，检验水准a0.05。
2 结 果
2.1 大鼠海马CA1区Caspase-3活性检测 与对照组相比，缺血再灌注组Caspase-3酶活性显著升高，随着再灌注时间的延长而逐渐增加，并且在缺血再灌注24 h时达到高峰(P<0.05)。详见图1。
图1 大鼠海马CA1区caspase-3酶活性变化
2.2 缺血再灌注后各蛋白磷酸化水平 NR1亚基作为NMDA受体的基本亚基，其磷酸化水平呈现逐渐升高的趋势，并且在24 h达到高峰，但在48 h时有明显下降，与对照组相比具有统计学意义(P<0.05，见图2)。NR2B亚基磷酸化水平与NR1亚基的磷酸化水平变化趋势相似 ......
摘要：目的 研究大鼠全脑短暂缺血再灌注后海马CA1区椎体神经元的死亡机制。方法采用经典的四血管夹闭法制作大鼠全脑缺血再灌注模型，取缺血再灌注后不同时间(6 h、24 h、48 h)的海马CA1区脑组织，用ELISA检测Caspase-3的活性变化。同时运用免疫印记方法检测PKC、NMDA受体NR2A及NR2B亚基磷酸化水平的变化。结果 与对照组相比，Caspase-3检测显示缺血再灌注6 h、24 h、48 h海马CA1区椎体神经元呈现逐渐凋亡增多的迟发性死亡。磷酸化蛋白激酶C在缺血6 h即有明显增高，并且于24 h、48 h达到表达高峰(P<0.05)；NMDA受体亚基NR2A和R2B的磷酸化水平缺血再灌注后均呈现明显升高趋势。讨论 PKC、NR2B、CaMⅡ级联反应的发生可能是大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区锥体神经元发生迟发性死亡的重要机制。
关键词：脑缺血再灌注；NMDA受体；神经元；凋亡；大鼠
中图分类号：R743.31 R258.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2011)07-0848-03
目前对缺血后脑损伤的机制尚未阐明，临床上也无理想的治疗手段[1,2]。海马CA1区锥体神经元对于缺血性损伤特别敏感。在缺血再灌注过程发生过程中，如果缺血过程较为短暂，则细胞死亡主要表现为迟发性的神经元死亡，即凋亡[3,4]。NMDA受体过度激活或不受调控的活化已经被证实牵涉在诸如脑中风、脑创伤等许多急慢性中枢神经系统病症中，并介导了兴奋毒性神经元死亡[5-11]。NMDA受体特异性拮抗剂的使用，发挥了不同程度的缺血再灌注后保护作用蛋白激酶C，属于丝氨酸/苏氨酸激酶的家族成员，在记忆的形成、诱导LTP和突触囊泡的释放中发挥着关键性的作[12]。用[13]。NMDA受体是PKC的潜在作用靶点，PKC可以使NR1、NR2B、NR2B等NMDA受体亚基发生磷酸化而活化[14,15]。钙调节蛋白酶Ⅱ(Calmodulin,CaMⅡ在神经元损伤继而发生的钙离子大量内流中发挥着重要作用，其与NMDA受体亚基NR2B亚基形成的复合物在神经元损伤中发挥着重要的作用。本研究旨在研究大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区NMDA受体NR1、NR2A、NR2B亚基的磷酸化水平变化及其与神经元死亡之间的关系，探索这种表达变化可能的上游调控因子。
1 材料与方法
1.1 动物模型制备 雄性Wistar大鼠50只(体重180 g～250 g)，由山西医科大学实验动物中心提供。采用改良Pulsinelli四血管夹闭方法进行短暂前脑缺血。大鼠存活6 h、24 h或48 h后进行相关实验。
1.2 Caspase-3活性检测 用酶标法测定脑组织裂解物中Caspase-3的活性，蛋白含量标准化校正后的OD 值：以正常组的活性为1，计算其余各组的相对活性。
1.3 Western-Blot检测 大鼠在短暂性全脑缺血15 min后再灌注，在缺血再灌注后不同时间点(6 h、24 h、48 h)断头取脑，分离出海马，并迅速在解剖显微镜下将海马CA1区组织分离出来。提取脑组织细胞膜蛋白样品。聚丙烯酰胺凝胶变性电泳(SDS-PAGE)及蛋白印迹完毕后，抗体按照1∶1 000稀释，β-actin作为内参。经KODAK IS440自显影系统进行曝光显影，使用KODAK MI软件进行吸光度值测定分析。
1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0 统计软件分析。数据以均数±标准差(x±s)表示，成组设计的多个样本均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，检验水准a0.05。
2 结 果
2.1 大鼠海马CA1区Caspase-3活性检测 与对照组相比，缺血再灌注组Caspase-3酶活性显著升高，随着再灌注时间的延长而逐渐增加，并且在缺血再灌注24 h时达到高峰(P<0.05)。详见图1。
图1 大鼠海马CA1区caspase-3酶活性变化
2.2 缺血再灌注后各蛋白磷酸化水平 NR1亚基作为NMDA受体的基本亚基，其磷酸化水平呈现逐渐升高的趋势，并且在24 h达到高峰，但在48 h时有明显下降，与对照组相比具有统计学意义(P<0.05，见图2)。NR2B亚基磷酸化水平与NR1亚基的磷酸化水平变化趋势相似 ......
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