神经节苷脂联合尼莫地平对脑缺血半暗带细胞凋亡及凋亡蛋白Bcl-2/Bax的影响
参见附件(12kb)。
摘要：目的 观察神经节苷脂GM1联合尼莫地平治疗对大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血半暗带神经细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的影响。方法 36只清洁级健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、 药物治疗组。线栓法制备大脑中动脉Bcl-2/Bax缺血再灌注模型(MCAO模型)，缺血2 h再灌注6 h，12 h，24 h，72 h。采用TUNEL法检测神经细胞凋亡，免疫组织化学法染色检测Bcl-2、Bax蛋白，并进行统计学分析。结果 与模型组比较，药物治疗组神经细胞凋亡计数随再灌注时间的延长显著减少(P<0.05)。 药物治疗组随再灌注时间延长，缺血半暗带区Bcl-2表达逐渐增强、以及Bax表达逐渐减弱，缺血2 h再灌注12 h后，Bcl-2/Bax比值达到高峰，与模型组比较有统计学意义(P<0.05)。结论 在脑缺血半暗带区，神经节苷脂联合尼莫地平干预治疗，通过上调Bcl-2表达，以及下调Bax表达，能够减少神经细胞凋亡，从而发挥神经细胞保护作用。
关键词：神经节苷脂；尼莫地平；再灌注损伤；免疫组化；凋亡；缺血半暗带
中图分类号：R743 R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2011)07-0852-02
1 材料与方法
1.1 动物与分组 成年健康雄性SD大鼠36只，体重250 g～280 g，清洁级，由北京大学医学部实验动物中心提供。应用线栓法经右侧颈总动脉插线建立右侧大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型，随机分为模型组(n16)：缺血2 h再灌注6 h、12 h、24 h、72 h组，即刻腹腔注射等量的生理盐水；药物治疗组(n16)：在模型组基础上给予腹腔注射神经节苷脂GM1(申捷)3.2 mg /kg、尼莫地平 1.6 mg/kg )。假手术组(n4)：假手术组除不插线外，其余步骤同模型组。
1.2 标本采集 模型组及治疗组动物在规定时间取材。分别于缺血2 h再灌注6 h、12 h、24 h、72 h取材，假手术组于手术后1 d取材。大鼠在10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉下，经左心室插管至升主动脉，依次灌入生理盐水200 mL、4%的多聚甲醛300 mL,灌注完毕后，断头取脑，自额极至枕叶分为5等份，取中间份石蜡包埋。制备厚5 μm的连续切片。
1.3 免疫组化染色 对各个组不同时间点脑组织中细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax进行染色。Bcl-2、Bax 蛋白检测Ⅰ抗(兔抗大鼠Bcl-2、BaxIgG),Ⅱ抗(生物素标记山羊抗兔IgG)。染色步骤按照免疫组化试剂盒说明进行。Bcl-2、Bax 均以胞浆出现棕黄色染色为阳性。免疫染色阴性对照采用PBS缓冲液代替Ⅰ抗。
1.4 TUNEL细胞凋亡检测 将石蜡包埋标本行冠状切片，厚5 μm，按TUNEL试剂盒说明书进行操作。光镜下阳性细胞核呈棕黄色。
1.5 统计学处理 计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间两两比较用LSD-t检验。
2 结 果
2.1 凋亡相关蛋白表达 假手术组Bcl-2、Bax表达很弱。模型组缺血侧皮质区随再灌注时间不同，Bcl-2、Bax表达不同。Bcl-2随着再灌注时间的延长，12 h阳性细胞数达高峰；Bax阳性细胞表达24 h达高峰。药物治疗组缺血2 h再灌注12 hBcl-2表达明显增多，阳性细胞计数明显高于模型组；而Bax表达：24 h阳性细胞计数明显低于模型组。再灌注12 h Bcl-2/Bax比值增高。详见表1、表2。
表1 缺血区皮层凋亡细胞及Bcl-2、Bax蛋白表达动态变化(x±s)
表2 缺血再灌注不同时间Bcl-2/Bax比较(x±s)
2.2 TUNEL表达 阳性细胞主要位于缺血周围区，缺血中心区未见阳性细胞表达。 假手术组有弱表达，胞核染色阳性，细胞体积较小且收缩变形。模型组缺血2 h再灌注24 h阳性细胞表达达高峰； 药物治疗组缺血半暗带区TUNEL阳性细胞表达，随再灌注时间延长，24 h达高峰，但少于模型组。
3 讨 论
外源性神经节苷脂进入血液后，与脂蛋白结合并由其运送，可通过血脑屏障嵌合于神经细胞胞浆膜中，对神经元细胞分化、生长、轴浆转运和再生起着重要作用，对神经元的损害有明显的保护作用[1]。而尼莫地平为二氢吡啶类钙通道阻滞剂，减少Ca2+内流，提高缺血区局部脑血流量。氧自由基的产生可诱导细胞发生凋亡[2] ......
摘要：目的 观察神经节苷脂GM1联合尼莫地平治疗对大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血半暗带神经细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的影响。方法 36只清洁级健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、 药物治疗组。线栓法制备大脑中动脉Bcl-2/Bax缺血再灌注模型(MCAO模型)，缺血2 h再灌注6 h，12 h，24 h，72 h。采用TUNEL法检测神经细胞凋亡，免疫组织化学法染色检测Bcl-2、Bax蛋白，并进行统计学分析。结果 与模型组比较，药物治疗组神经细胞凋亡计数随再灌注时间的延长显著减少(P<0.05)。 药物治疗组随再灌注时间延长，缺血半暗带区Bcl-2表达逐渐增强、以及Bax表达逐渐减弱，缺血2 h再灌注12 h后，Bcl-2/Bax比值达到高峰，与模型组比较有统计学意义(P<0.05)。结论 在脑缺血半暗带区，神经节苷脂联合尼莫地平干预治疗，通过上调Bcl-2表达，以及下调Bax表达，能够减少神经细胞凋亡，从而发挥神经细胞保护作用。
关键词：神经节苷脂；尼莫地平；再灌注损伤；免疫组化；凋亡；缺血半暗带
中图分类号：R743 R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2011)07-0852-02
1 材料与方法
1.1 动物与分组 成年健康雄性SD大鼠36只，体重250 g～280 g，清洁级，由北京大学医学部实验动物中心提供。应用线栓法经右侧颈总动脉插线建立右侧大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型，随机分为模型组(n16)：缺血2 h再灌注6 h、12 h、24 h、72 h组，即刻腹腔注射等量的生理盐水；药物治疗组(n16)：在模型组基础上给予腹腔注射神经节苷脂GM1(申捷)3.2 mg /kg、尼莫地平 1.6 mg/kg )。假手术组(n4)：假手术组除不插线外，其余步骤同模型组。
1.2 标本采集 模型组及治疗组动物在规定时间取材。分别于缺血2 h再灌注6 h、12 h、24 h、72 h取材，假手术组于手术后1 d取材。大鼠在10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉下，经左心室插管至升主动脉，依次灌入生理盐水200 mL、4%的多聚甲醛300 mL,灌注完毕后，断头取脑，自额极至枕叶分为5等份，取中间份石蜡包埋。制备厚5 μm的连续切片。
1.3 免疫组化染色 对各个组不同时间点脑组织中细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax进行染色。Bcl-2、Bax 蛋白检测Ⅰ抗(兔抗大鼠Bcl-2、BaxIgG),Ⅱ抗(生物素标记山羊抗兔IgG)。染色步骤按照免疫组化试剂盒说明进行。Bcl-2、Bax 均以胞浆出现棕黄色染色为阳性。免疫染色阴性对照采用PBS缓冲液代替Ⅰ抗。
1.4 TUNEL细胞凋亡检测 将石蜡包埋标本行冠状切片，厚5 μm，按TUNEL试剂盒说明书进行操作。光镜下阳性细胞核呈棕黄色。
1.5 统计学处理 计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间两两比较用LSD-t检验。
2 结 果
2.1 凋亡相关蛋白表达 假手术组Bcl-2、Bax表达很弱。模型组缺血侧皮质区随再灌注时间不同，Bcl-2、Bax表达不同。Bcl-2随着再灌注时间的延长，12 h阳性细胞数达高峰；Bax阳性细胞表达24 h达高峰。药物治疗组缺血2 h再灌注12 hBcl-2表达明显增多，阳性细胞计数明显高于模型组；而Bax表达：24 h阳性细胞计数明显低于模型组。再灌注12 h Bcl-2/Bax比值增高。详见表1、表2。
表1 缺血区皮层凋亡细胞及Bcl-2、Bax蛋白表达动态变化(x±s)
表2 缺血再灌注不同时间Bcl-2/Bax比较(x±s)
2.2 TUNEL表达 阳性细胞主要位于缺血周围区，缺血中心区未见阳性细胞表达。 假手术组有弱表达，胞核染色阳性，细胞体积较小且收缩变形。模型组缺血2 h再灌注24 h阳性细胞表达达高峰； 药物治疗组缺血半暗带区TUNEL阳性细胞表达，随再灌注时间延长，24 h达高峰，但少于模型组。
3 讨 论
外源性神经节苷脂进入血液后，与脂蛋白结合并由其运送，可通过血脑屏障嵌合于神经细胞胞浆膜中，对神经元细胞分化、生长、轴浆转运和再生起着重要作用，对神经元的损害有明显的保护作用[1]。而尼莫地平为二氢吡啶类钙通道阻滞剂，减少Ca2+内流，提高缺血区局部脑血流量。氧自由基的产生可诱导细胞发生凋亡[2] ......
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