止颤汤对神经干细胞移植后帕金森病大鼠尿液中DA及其代谢产物含量的影响
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摘要：目的 观察止颤汤对神经干细胞(NSC)移植后帕金森病(PD)大鼠尿液中多巴胺(DA)及其代谢产物含量的影响，探讨其对NSC移植后存活及定向分化的作用。方法 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)脑内定向注射建立PD大鼠模型，经NSC移植后予止颤汤灌胃。应用高效液相色谱法(HPLC)测定PD大鼠尿液中DA及其代谢产物高香草酸(HVA)、双羟苯乙酸(DOPAC)的含量。结果 止颤汤可以提高NSC移植后PD大鼠尿液中DA及其代谢产物的含量并改善其行为学。结论 止颤汤可能促进PD大鼠脑内NSC移植后的存活，并且分化为多巴胺能神经元发挥功能，同时抑制DA排泄，从而达到治疗作用。
关键词：帕金森病；止颤汤；干细胞移植；DA代谢；大鼠
中图分类号：R742.5 R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2011)08-0975-02
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是由于多种原因导致脑内黑质多巴胺(Dopamine，DA)能神经元退行性病变从而DA分泌减少引起的。干细胞移植是PD的理想治疗方法[1]，通过干细胞中最适合于中枢神经系统细胞替代治疗的神经干细胞(neural stem cell，NSC)移植以期重建PD患者DA能神经元的功能。因此如何促使移植入脑内的NSC存活且定向分化为DA能神经元，并发挥功能成为亟得解决的问题。本实验观察了中药复方止颤汤对NSC移植后PD大鼠尿液中DA及其代谢产物含量的影响，以期为解决NSC移植治疗PD中的疑难问题提供中医药实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 Wistar大鼠48只，均为雄性，体重260 g±20 g，由上海斯莱克实验动物中心提供，动物编号：SCXK(沪)2007-0005。
1.2 药品与试剂 止颤汤主要由黄芪、丹参、白芍、升麻、知母、钩藤等8味中药组成。诸药均经鉴定符合药典规定的质量标准。高效液相所用的标准品DA、DOPAC、HVA：美国Sigma公司。
1.3 主要仪器 鼠脑立体定位仪：上海江湾Ⅱ型，液相色谱仪：HPLC Agilent 1200，Agilent Zorbax oligo 80 mm×6.2 mm,5 μm column。
1.4 方法
1.4.1 模型制备 采用大鼠脑立体定位MPTP注射法制模[2]。术后14 d，颈部皮下注射诱导剂阿扑吗啡(Apo)后，测量大鼠30 min内向损毁侧旋转总次数，若大鼠旋转圈数>210 r/30 min(>7 r/min)，视为成功PD大鼠模型。
1.4.2 NSC的分离培养及鉴定 参照文献[3]，选取孕14 d的Wistar大鼠胚胎，分离出中脑组织，机械消化成单细胞悬液，种植于塑料培养瓶中，5%二氧化碳，37 ℃环境中培养，待原代克隆出现后(7 d～10 d)，离心收集神经球，胰酶消化，吹打成单细胞悬液，1×105 /mL浓度种植于新培液中，每7 d换液传代1次，离心收集形成的神经球，经甩片到多聚赖氨酸包被的玻片上，固定后进行免疫细胞染色，检测NSC特异性蛋白Nestin的表达，鉴定所培养细胞中NSC细胞数量及传代后生长情况。
1.4.3 动物分组及给药 将48只大鼠随机分为4组。NSC移植组：大鼠PD模型制作后，将NSC注射入PD大鼠损毁侧黑质纹状体内，同时用生理盐水4 mL，每天分2次灌胃。正常组：正常大鼠，脑内同一位置注射等量培养基，同时用生理盐水4 mL，每天分2次灌胃。模型组：模型制作后，同正常组处理。止颤汤组：同样方法将NSC移植入PD大鼠模型，同时将止颤汤1.2 mL/100 g用生理盐水稀释为4 mL，每天分2次灌胃。
1.4.4 行为学测试 分别于处理后7 d、14 d、28 d颈部皮下注射阿扑吗啡，诱发其旋转行为，动物旋转时以患侧后肢为支点、身体环曲、首尾相接的原地旋转，伴觅食样动作，旋转360°为一转，30 min内记录大鼠的旋转圈数。
1.4.5 取材及材料处理 动物在处理后第28天末次灌胃后进行行为学测试，次日晨收集尿液置入-80 ℃超低温冰箱保存备用。测样时，室温下解冻，每次进样10 μL。高效液相色谱法检测DA、DOPAC及HVA含量[4]。
1.5 统计学处理 数据以均数±标准差(x±s)表示 ......
摘要：目的 观察止颤汤对神经干细胞(NSC)移植后帕金森病(PD)大鼠尿液中多巴胺(DA)及其代谢产物含量的影响，探讨其对NSC移植后存活及定向分化的作用。方法 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)脑内定向注射建立PD大鼠模型，经NSC移植后予止颤汤灌胃。应用高效液相色谱法(HPLC)测定PD大鼠尿液中DA及其代谢产物高香草酸(HVA)、双羟苯乙酸(DOPAC)的含量。结果 止颤汤可以提高NSC移植后PD大鼠尿液中DA及其代谢产物的含量并改善其行为学。结论 止颤汤可能促进PD大鼠脑内NSC移植后的存活，并且分化为多巴胺能神经元发挥功能，同时抑制DA排泄，从而达到治疗作用。
关键词：帕金森病；止颤汤；干细胞移植；DA代谢；大鼠
中图分类号：R742.5 R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2011)08-0975-02
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是由于多种原因导致脑内黑质多巴胺(Dopamine，DA)能神经元退行性病变从而DA分泌减少引起的。干细胞移植是PD的理想治疗方法[1]，通过干细胞中最适合于中枢神经系统细胞替代治疗的神经干细胞(neural stem cell，NSC)移植以期重建PD患者DA能神经元的功能。因此如何促使移植入脑内的NSC存活且定向分化为DA能神经元，并发挥功能成为亟得解决的问题。本实验观察了中药复方止颤汤对NSC移植后PD大鼠尿液中DA及其代谢产物含量的影响，以期为解决NSC移植治疗PD中的疑难问题提供中医药实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 Wistar大鼠48只，均为雄性，体重260 g±20 g，由上海斯莱克实验动物中心提供，动物编号：SCXK(沪)2007-0005。
1.2 药品与试剂 止颤汤主要由黄芪、丹参、白芍、升麻、知母、钩藤等8味中药组成。诸药均经鉴定符合药典规定的质量标准。高效液相所用的标准品DA、DOPAC、HVA：美国Sigma公司。
1.3 主要仪器 鼠脑立体定位仪：上海江湾Ⅱ型，液相色谱仪：HPLC Agilent 1200，Agilent Zorbax oligo 80 mm×6.2 mm,5 μm column。
1.4 方法
1.4.1 模型制备 采用大鼠脑立体定位MPTP注射法制模[2]。术后14 d，颈部皮下注射诱导剂阿扑吗啡(Apo)后，测量大鼠30 min内向损毁侧旋转总次数，若大鼠旋转圈数>210 r/30 min(>7 r/min)，视为成功PD大鼠模型。
1.4.2 NSC的分离培养及鉴定 参照文献[3]，选取孕14 d的Wistar大鼠胚胎，分离出中脑组织，机械消化成单细胞悬液，种植于塑料培养瓶中，5%二氧化碳，37 ℃环境中培养，待原代克隆出现后(7 d～10 d)，离心收集神经球，胰酶消化，吹打成单细胞悬液，1×105 /mL浓度种植于新培液中，每7 d换液传代1次，离心收集形成的神经球，经甩片到多聚赖氨酸包被的玻片上，固定后进行免疫细胞染色，检测NSC特异性蛋白Nestin的表达，鉴定所培养细胞中NSC细胞数量及传代后生长情况。
1.4.3 动物分组及给药 将48只大鼠随机分为4组。NSC移植组：大鼠PD模型制作后，将NSC注射入PD大鼠损毁侧黑质纹状体内，同时用生理盐水4 mL，每天分2次灌胃。正常组：正常大鼠，脑内同一位置注射等量培养基，同时用生理盐水4 mL，每天分2次灌胃。模型组：模型制作后，同正常组处理。止颤汤组：同样方法将NSC移植入PD大鼠模型，同时将止颤汤1.2 mL/100 g用生理盐水稀释为4 mL，每天分2次灌胃。
1.4.4 行为学测试 分别于处理后7 d、14 d、28 d颈部皮下注射阿扑吗啡，诱发其旋转行为，动物旋转时以患侧后肢为支点、身体环曲、首尾相接的原地旋转，伴觅食样动作，旋转360°为一转，30 min内记录大鼠的旋转圈数。
1.4.5 取材及材料处理 动物在处理后第28天末次灌胃后进行行为学测试，次日晨收集尿液置入-80 ℃超低温冰箱保存备用。测样时，室温下解冻，每次进样10 μL。高效液相色谱法检测DA、DOPAC及HVA含量[4]。
1.5 统计学处理 数据以均数±标准差(x±s)表示 ......
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