清热化瘀方对脑缺血再灌注损伤大鼠神经干细胞增殖的影响(2)
参见附件(12kb)。
1) 为广西自然科学基金项目(No.桂科自0832171)，广西中医学院自然科学研究课题(No.G2006015)
1.7 细胞图像分析 用计算机图像分析系统软件计数脑梗死后不同时间段侧脑室室管膜下层(SVZ)阳性细胞数。每个动物随机选取相同位置的6张脑片，每个脑片在大鼠脑缺血半暗带随机选取6个视野 (×400)，求得Nestin、BrdU阳性细胞的平均光密度值。
1.8 统计学处理 所有数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 大鼠神经功能缺损评分的比较 大鼠造模后，出现不同程度的神经功能缺损，其症状一般在24 h后逐渐减轻，至术后第21天，两组大鼠的神经功能缺损和第2天相比明显改善(P<0.05)；清热化瘀组大鼠在第2天、第4天、第7天的神经功能缺损评分显著优于模型组(P<0.05)。详见表1。
表1 两组大鼠神经功能评分变化(x±s)分
2.2 各组大鼠Nestin蛋白表达平均光密度值比较 假手术组大鼠Nestin标记的阳性细胞仅见于侧脑室室管膜、室管膜下区等处，在大鼠皮质等其他脑组织未见Nestin表达。模型组缺血半暗带各个时间点Nestin表达的平均光密度与假手术组比较有统计学意义(P<0.01)，其表达于再灌注7 d达高峰(P<0.05)，以后表达逐渐减弱；与模型组相比，清热化瘀组可以明显增加缺血再灌注后第4天、第7天、第14天大鼠缺血半暗带的Nestin阳性细胞表达(P< 0.05)。详见表2。
表2 各组大鼠Nestin蛋白表达的光密度OD值比较(x±s)
2.3 各组大鼠BrdU阳性细胞平均光密度值比较 假手术组BrdU标记的细胞仅局限在海马齿状回颗粒下层(SGZ)、SVZ等脑区，在大鼠皮质等其他脑组织未见BrdU阳性细胞。脑缺血再灌注2 d时，缺血半暗带BrdU阳性细胞核数目较少，分布疏散；再灌注4 d，BrdU阳性细胞数开始显著增加，可见多个染色较深的细胞核聚集；再灌注14 d达高峰(P<0.05)，以后表达逐渐减弱。与模型组比较，清热化瘀组可以明显增加缺血再灌注后第7天、第14天、第21天大鼠缺血半暗带的BrdU阳性细胞表达(P<0.05)。详见表3。
表3 各组大鼠BrdU阳性细胞光密度OD值比较(x±s)
3 讨 论
越来越多的证据表明，哺乳动物中枢神经系统有产生新神经元和修复受损区的能力，中枢神经系统这种能力与脑内的NSC是分不开的。正常情况下，NSC以静止、不增殖状态存在。脑缺血时可促进SVZ和海马齿状回等处的神经干细胞增殖、分化和迁移[2]。随着再灌注时间的延长，表达不同特性的反应性神经干细胞开始增多，提示与神经细胞的修复有关[3]。Nestin是神经干细胞的特异性标记蛋白，随神经细胞的成熟而停止表达。神经干细胞发生分裂增殖后，与标记细胞增殖的药物BrdU结合，现在这两种指标被广泛用于神经干细胞的研究中。“毒损脑络”学说是中医中风认识上的新理论，认为中风发病是由于毒邪损伤脑络，络脉破损或络脉拘挛瘀闭，气血渗灌失常所致[4]。结合脑缺血损伤后 NSC的变化，认为脑缺血急性期产生的痰瘀热毒混杂脑内，损伤脑髓及脑络，NSC的增殖分化迁移之源受到抑制、破坏，导致神经功能缺损及功能恢复受限。因此认为，解毒通络是治疗大法[5]，据此理论而设的清热化瘀方，其功效为清热解毒化痰、活血化瘀通络，是治疗脑梗死的有效方剂，一系列研究表明其通过不同途径对脑缺血损伤组织具有保护作用，作为脑神经功能保护剂在临床运用有较好的疗效[6-8] ......
1) 为广西自然科学基金项目(No.桂科自0832171)，广西中医学院自然科学研究课题(No.G2006015)
1.7 细胞图像分析 用计算机图像分析系统软件计数脑梗死后不同时间段侧脑室室管膜下层(SVZ)阳性细胞数。每个动物随机选取相同位置的6张脑片，每个脑片在大鼠脑缺血半暗带随机选取6个视野 (×400)，求得Nestin、BrdU阳性细胞的平均光密度值。
1.8 统计学处理 所有数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 大鼠神经功能缺损评分的比较 大鼠造模后，出现不同程度的神经功能缺损，其症状一般在24 h后逐渐减轻，至术后第21天，两组大鼠的神经功能缺损和第2天相比明显改善(P<0.05)；清热化瘀组大鼠在第2天、第4天、第7天的神经功能缺损评分显著优于模型组(P<0.05)。详见表1。
表1 两组大鼠神经功能评分变化(x±s)分
2.2 各组大鼠Nestin蛋白表达平均光密度值比较 假手术组大鼠Nestin标记的阳性细胞仅见于侧脑室室管膜、室管膜下区等处，在大鼠皮质等其他脑组织未见Nestin表达。模型组缺血半暗带各个时间点Nestin表达的平均光密度与假手术组比较有统计学意义(P<0.01)，其表达于再灌注7 d达高峰(P<0.05)，以后表达逐渐减弱；与模型组相比，清热化瘀组可以明显增加缺血再灌注后第4天、第7天、第14天大鼠缺血半暗带的Nestin阳性细胞表达(P< 0.05)。详见表2。
表2 各组大鼠Nestin蛋白表达的光密度OD值比较(x±s)
2.3 各组大鼠BrdU阳性细胞平均光密度值比较 假手术组BrdU标记的细胞仅局限在海马齿状回颗粒下层(SGZ)、SVZ等脑区，在大鼠皮质等其他脑组织未见BrdU阳性细胞。脑缺血再灌注2 d时，缺血半暗带BrdU阳性细胞核数目较少，分布疏散；再灌注4 d，BrdU阳性细胞数开始显著增加，可见多个染色较深的细胞核聚集；再灌注14 d达高峰(P<0.05)，以后表达逐渐减弱。与模型组比较，清热化瘀组可以明显增加缺血再灌注后第7天、第14天、第21天大鼠缺血半暗带的BrdU阳性细胞表达(P<0.05)。详见表3。
表3 各组大鼠BrdU阳性细胞光密度OD值比较(x±s)
3 讨 论
越来越多的证据表明，哺乳动物中枢神经系统有产生新神经元和修复受损区的能力，中枢神经系统这种能力与脑内的NSC是分不开的。正常情况下，NSC以静止、不增殖状态存在。脑缺血时可促进SVZ和海马齿状回等处的神经干细胞增殖、分化和迁移[2]。随着再灌注时间的延长，表达不同特性的反应性神经干细胞开始增多，提示与神经细胞的修复有关[3]。Nestin是神经干细胞的特异性标记蛋白，随神经细胞的成熟而停止表达。神经干细胞发生分裂增殖后，与标记细胞增殖的药物BrdU结合，现在这两种指标被广泛用于神经干细胞的研究中。“毒损脑络”学说是中医中风认识上的新理论，认为中风发病是由于毒邪损伤脑络，络脉破损或络脉拘挛瘀闭，气血渗灌失常所致[4]。结合脑缺血损伤后 NSC的变化，认为脑缺血急性期产生的痰瘀热毒混杂脑内，损伤脑髓及脑络，NSC的增殖分化迁移之源受到抑制、破坏，导致神经功能缺损及功能恢复受限。因此认为，解毒通络是治疗大法[5]，据此理论而设的清热化瘀方，其功效为清热解毒化痰、活血化瘀通络，是治疗脑梗死的有效方剂，一系列研究表明其通过不同途径对脑缺血损伤组织具有保护作用，作为脑神经功能保护剂在临床运用有较好的疗效[6-8] ......
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