黄芪皂甙Ⅳ联合BMSCs移植对大鼠脑缺血再灌注海马神经细胞凋亡及Livin\Caspase-9蛋白的影响(2)
参见附件(12kb)。
最近研究发现，移植骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell，BMSCs)可以改善缺血性脑损伤动物的神经功能[3]，为解决脑卒中治疗这一难题带来了新的曙光。黄芪皂甙Ⅳ是一种纯化小分子皂甙(分子量 784)，作为黄芪的主要活性成分[4]，已被广泛地应用于缺血性脑血管病的治疗。但关于黄芪皂甙Ⅳ联合BMSCs治疗脑缺血再灌注损伤的研究，尚未见报道。本研究通过建立大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)模型，观察并分析黄芪皂甙Ⅳ联合BMSCs移植对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能恢复的作用，以及对大鼠脑组织神经细胞凋亡及Livin、Caspase-9蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 动物、药品及试剂 雄性SD大鼠42只，清洁级，体重280 g～320 g，购于中国医科大学实验动物中心,许可证号:SYXK[辽]2003-0013。黄芪皂甙Ⅳ由西安赛邦医药提供，纯度98%，用时以生理盐水配成质量浓度为1.0 mg/mL。兔抗大鼠Livin抗体、兔抗大鼠Caspase-9抗体、免疫组化SP试剂盒、DAB显色试剂盒、TUNEL试剂盒购于北京中山生物试剂公司桥生物公司；PKH-26试剂盒购于Sigma公司，抗β-actin抗体购于Santa Cruz公司。
1.2 BMSCs培养 体质量100 g～120 g健康雄性SD大鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下取双侧胫骨和股骨，用DMEM培养液冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液，平均分装在2个50 mL培养瓶中，每瓶加至培养基5 mL，放入37 ℃，5%CO2培养箱中培养；待贴壁细胞完全融合后，2.5 g/L胰酶消化传代。当细胞传至第三代时制成单细胞悬液。
1.3 PKH-26标记BMSCs 胰酶和/或EDTA消化BMSCs形成单细胞悬液。2×107细胞于锥形离心管中，用无血清培养基洗1次；离心5 min；吸去上清，加1 mL稀释液C，重悬细胞保证完全离散，不要震荡。染色前，准备4×106mol/L的PKH26染液(用稀释液C稀释)置于离心管中，尽快加1 mL 2×细胞到1 mL 2×染料，立即用吸管均匀快速混合样品，25 ℃孵育的2 min～5 min，定时轻轻颠倒离心管保证在25 ℃充分混匀；加入等量血清或1%BSA中止染色反应，孵育1 min；用等量含血清培养基稀释中止的反应液；400 g、25 ℃离心10 min，去上清；细胞团转入新试管中，进一步洗3次；加10 mL完全培养基，离心，重新悬置细胞。
1.4 动物分组与模型制备 大鼠按体重分层，随机分为4组：假手术组(6只)、模型组(12只)、BMSCs组(12只)、联合组(12只)。参照Longa等[5]的线栓改良法复制大鼠左侧大脑MCAO局灶性脑缺血模型。4组分别于建模成功后3 h分别经尾静脉注射等体积的PBS液和已制备好的PKH-26标记的同种异体BMSCs悬液，BMSCs组和联合组每只大鼠移植细胞数为4×106个。联合组于缺血前5 min及缺血后12 h、24 h腹腔注射黄芪皂甙Ⅳ(20 mg/kg)。
1.5 神经功能评估 动物缺血2 h拔线栓后,按Longa方法[5]进行神经功能缺损。评分在1 分～3分视为造模成功,否则弃之不用。保证各组每个时间点的动物数目。由一位不了解分组情况的观察者在灌流后72 h评估记录神经行为学评分。
1.6 免疫组织化学检测 取材行冰冻切片，在视交叉后1 mm～4 mm处冠状切面切开，在海马齿状平面连续冠状切片，片厚4 μm。0.5%过氧化氢孵育10 min；PBS漂洗3次，正常山羊血清37 ℃孵育15 min后，滴加稀释后的一抗Livin(1∶100)、Caspase-9(1∶150)，4 ℃过夜。滴加生物素标记体，30 min，37 ℃。滴加过氧化物-链霉素卵白素37 ℃ ......
最近研究发现，移植骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell，BMSCs)可以改善缺血性脑损伤动物的神经功能[3]，为解决脑卒中治疗这一难题带来了新的曙光。黄芪皂甙Ⅳ是一种纯化小分子皂甙(分子量 784)，作为黄芪的主要活性成分[4]，已被广泛地应用于缺血性脑血管病的治疗。但关于黄芪皂甙Ⅳ联合BMSCs治疗脑缺血再灌注损伤的研究，尚未见报道。本研究通过建立大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)模型，观察并分析黄芪皂甙Ⅳ联合BMSCs移植对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能恢复的作用，以及对大鼠脑组织神经细胞凋亡及Livin、Caspase-9蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 动物、药品及试剂 雄性SD大鼠42只，清洁级，体重280 g～320 g，购于中国医科大学实验动物中心,许可证号:SYXK[辽]2003-0013。黄芪皂甙Ⅳ由西安赛邦医药提供，纯度98%，用时以生理盐水配成质量浓度为1.0 mg/mL。兔抗大鼠Livin抗体、兔抗大鼠Caspase-9抗体、免疫组化SP试剂盒、DAB显色试剂盒、TUNEL试剂盒购于北京中山生物试剂公司桥生物公司；PKH-26试剂盒购于Sigma公司，抗β-actin抗体购于Santa Cruz公司。
1.2 BMSCs培养 体质量100 g～120 g健康雄性SD大鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下取双侧胫骨和股骨，用DMEM培养液冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液，平均分装在2个50 mL培养瓶中，每瓶加至培养基5 mL，放入37 ℃，5%CO2培养箱中培养；待贴壁细胞完全融合后，2.5 g/L胰酶消化传代。当细胞传至第三代时制成单细胞悬液。
1.3 PKH-26标记BMSCs 胰酶和/或EDTA消化BMSCs形成单细胞悬液。2×107细胞于锥形离心管中，用无血清培养基洗1次；离心5 min；吸去上清，加1 mL稀释液C，重悬细胞保证完全离散，不要震荡。染色前，准备4×106mol/L的PKH26染液(用稀释液C稀释)置于离心管中，尽快加1 mL 2×细胞到1 mL 2×染料，立即用吸管均匀快速混合样品，25 ℃孵育的2 min～5 min，定时轻轻颠倒离心管保证在25 ℃充分混匀；加入等量血清或1%BSA中止染色反应，孵育1 min；用等量含血清培养基稀释中止的反应液；400 g、25 ℃离心10 min，去上清；细胞团转入新试管中，进一步洗3次；加10 mL完全培养基，离心，重新悬置细胞。
1.4 动物分组与模型制备 大鼠按体重分层，随机分为4组：假手术组(6只)、模型组(12只)、BMSCs组(12只)、联合组(12只)。参照Longa等[5]的线栓改良法复制大鼠左侧大脑MCAO局灶性脑缺血模型。4组分别于建模成功后3 h分别经尾静脉注射等体积的PBS液和已制备好的PKH-26标记的同种异体BMSCs悬液，BMSCs组和联合组每只大鼠移植细胞数为4×106个。联合组于缺血前5 min及缺血后12 h、24 h腹腔注射黄芪皂甙Ⅳ(20 mg/kg)。
1.5 神经功能评估 动物缺血2 h拔线栓后,按Longa方法[5]进行神经功能缺损。评分在1 分～3分视为造模成功,否则弃之不用。保证各组每个时间点的动物数目。由一位不了解分组情况的观察者在灌流后72 h评估记录神经行为学评分。
1.6 免疫组织化学检测 取材行冰冻切片，在视交叉后1 mm～4 mm处冠状切面切开，在海马齿状平面连续冠状切片，片厚4 μm。0.5%过氧化氢孵育10 min；PBS漂洗3次，正常山羊血清37 ℃孵育15 min后，滴加稀释后的一抗Livin(1∶100)、Caspase-9(1∶150)，4 ℃过夜。滴加生物素标记体，30 min，37 ℃。滴加过氧化物-链霉素卵白素37 ℃ ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(12kb)。