脂联素对高糖环境下人心肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2表达的影响(1)
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摘要：目的 探讨脂联素(ADPN)对高糖环境下人心肌细胞株(HCM)的凋亡及凋亡因子Bax、Bcl-2表达的影响，揭示脂联素对高糖环境中心肌细胞可能的保护机制。方法 将培养的HCM随机分为正常对照组、高糖组、高糖+脂联素组，分别培养24 h、48 h、72 h，运用MTT法测定不同时间段细胞增殖情况；流式细胞术测定细胞凋亡率；实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术测定细胞Bax/Bcl-2表达情况。结果 与对照组相比，高糖持续作用抑制细胞增殖，增加细胞凋亡率，并使Bax表达上调，而Bcl-2表达下降。脂联素组细胞增殖明显增加，并通过下调Bax和上调Bcl-2抑制细胞凋亡，且该作用呈时间依赖性，与高糖组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 脂联素可以抑制心肌细胞凋亡，对高糖作用下的心肌细胞具有保护作用。
关键词：脂联素；人心肌细胞；Bax/Bcl-2；糖尿病；心肌病
中图分类号：R329.3 R587.1 文献标识码：B 文章编号：1672-1349(2012)01-0037-03
近年多项研究表明，在众多脂肪细胞分泌的蛋白和代谢物中，脂联素(ADPN)是唯一提高胰岛素敏感性、对心血管具有保护作用因子。本研究旨在探讨脂联素对高糖环境下心肌细胞凋亡的影响，以揭示脂联素对糖尿病心肌病(DCM)中心肌细胞的可能保护机制，为防治糖尿病心肌病提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料 人心肌细胞株(HCM)购于美国SinceCell公司上海代购，DMEM培养基(美国HyClone公司)，胰蛋白酶(北京Solarbio公司)，胎牛血清(美国HyClone公司)，D-葡萄糖(北京Solarbio公司)，MTT试剂盒(美国Sigma公司)，脂联素(Human gAcrp 美国Pepro Tech公司)，Trizol试剂(上海生工生物工程有限公司)，FastStart Universal SYRB Green Master(ROX，美国Roche公司)。Bax引物，上游：5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3′；下游：5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′。Bcl-2引物，上游：5′-GGATGCCTTTGTGGAACTGT-3′；下游：5′-AGCCTGCAGCTTTGTTTCAT-3′。β-actin引物，上游：5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′；下游：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′184bp( 上海生工生物工程有限公司)。
1.2 人心肌细胞的培养及分组 HCM培养于含10%胎牛血清，5.5 mmol/L D-葡萄糖，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，并置于37 ℃含5%的CO2的孵箱中孵育，细胞生长至约85%融合时，用0.25%的胰蛋白酶消化传代。正常对照组D-葡萄糖浓度5.5 mmol/L;高糖组D-葡萄糖浓度30.0 mmol/L；高糖加脂联素组D-葡萄糖浓度30.0 mmol/L+ADPN 2.5 μg/mL。
1.3 实验方法
1.3.1 MTT法 取部分生长状态佳的细胞，以1×104个/mL接种至96孔板，待细胞贴壁后，改用无血清培养基培养6 h。按照实验分组进行干预，每组设3个复孔，同时设凋零孔，分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入MTT 20 μL，孵育4 h后，每孔加入DMSO150 μL，振荡10 min，待DMSO溶解后，于酶标仪490 nm处测得吸光度OD值。
1.3.2 流式细胞术 取部分生长状态佳的细胞，以1×105个/mL接种至6孔板，待细胞贴壁后，改用无血清培养基培养6 h，使细胞同步化，弃去培养液，按照实验分组进行干预，每组设3个复孔，分别培养24 h、48 h、72 h，用脂结合蛋白AnnexinV/碘化丙啶(PI)双染色标记后，流式细胞仪测细胞的凋亡百分率。结果判断，正常活细胞AnnexinV/PI均低染；凋亡细胞AnnexinV高染，PI低染；坏死细胞AnnexinV/PI均高染。
1.3.3 荧光定量PCR 总RNA的提取,细胞生长至约80%融合时，弃去培养基，加入无血清培养基6 h后，按实验分组进行干预，弃去上清，加入Trizol试剂提取总RNA。将RNA反转录为cDNA。 目的基因Bax引物，上游：5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3′；下游：5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′。Bcl-2引物，上游：5′-GGATGCCTTTGTGGAACTGT-3′；下游：5′-AGCCTGCAGCTTTGTTTCAT。β-actin引物，上游：5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′；下游：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′184 bp。PCR反应体系：FastStart Universal SYRB Green Master(ROX)，上游引物(15 μmol)，下游引物(15 μmol),cDNA，无DNAse和RNAse水。PCR反应条件：95 ℃变性10 min，95 ℃15 s，58 ℃45 s，共45个循环。由PCR反应曲线得到Ct值，采用2-△△Ct方法计算相对定量结果。
1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用方差分析进行组间比较。
2 结 果
2.1 MTT结果 与对照组相比，高糖组细胞在24 h时，细胞增殖增加，48 h、72 h细胞增殖受到抑制(P<0.05)。脂联素组与高糖组相比，24 h时细胞增殖情况无统计学意义，48 h、72 h细胞增殖明显增加(P<0.05)。详见表1。
2.2 流式细胞术 与对照组相比，高糖组的细胞在各个时间段凋亡率均增加(P<0.05)。脂联素组与高糖组相比，48 h、72 h细胞凋亡率均减少(P<0.05)。各时间段脂联素组之间差异有统计学意义，随着时间推移，细胞凋亡率降低。详见表2 ......
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