吡格列酮对缺血再灌注大鼠心肌细胞内质网应激致凋亡途径的影响(1)
摘要：目的观察吡格列酮对大鼠心肌细胞缺血再灌注(I/R)损伤(MIRI)后GRP78和caspase-12蛋白表达的影响,探讨吡格列酮内质网应激途径的心肌保护。方法 Wistar大鼠30只随机分为I/R+Pio组[灌服5 mg/(kg•d)]、I/R组及假手术组，各10只。制作大鼠心肌再灌注损伤模型。TUNEL检测心肌细胞凋亡,免疫组织化学检测GRP78和caspase-12表达变化。结果 吡格列酮预处理组大鼠心肌细胞凋亡及GRP78、caspase-12蛋白表达水平明显比I/R组减少(P<0.05)。结论 通过内质网应激途径可能是吡格列酮对心肌再灌注损伤的保护作用机制之一。
关键词:心肌缺血再灌注;细胞凋亡;吡格列酮
中图分类号：R542.2 R329.2 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2012)01-0069-03
心肌缺血-再灌注损伤 (myocardial ischemia-reperfusion injury MIRI)是阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得最佳疗效的主要难题，无论是溶栓、介入，还是外科搭桥、心脏移植手术。I/R时心肌细胞死亡既有坏死也有凋亡,且凋亡是决定梗死面积大小的主要因素,尤其在I/R早期心肌细胞凋亡(MA)作用更为明显[1]。目前研究认为调控细胞凋亡的信号转导通路主的致细胞凋亡重要途径。研究发现噻唑烷二酮类(thiazolidinediones,TZDs)胰岛素增敏剂为过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator - activated receptor gamma，PPARγ)的高亲和配体,可减轻MIRI时心肌梗死面积,改善心功能,起抗MIRI作用,主要机制是减轻再灌注时心肌细胞的凋亡[2]。本文观察吡格列酮对内质网应激反应的影响,探讨吡格列酮在内质网应激途径对心肌的保护作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物分组 健康Wistar雄性大鼠(山西医科大学生理实验中心提供)30只，体重180 g～220 g，随机分为3组，I/R+ Pio组，灌服吡格列酮5 mg/(kg•d),溶于2 mL生理盐水中，共14 d；I/R组及假手术组，灌服生理盐水，2 mL/d，共14 d。
1.2 药品与试剂 盐酸吡格列酮片(艾可拓，日本武田药品工业株式会社生产)，GRP-78、caspace-12蛋白一抗为兔抗大鼠多克隆抗体 (北京博奥森)；二抗为羊抗兔SABC免疫组化试剂盒、TUNEL检测试剂盒(博士德公司)。
1.3 动物模型制作 乌拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉，气管插管进行呼吸机辅助呼吸(HX200动物呼吸机，成都泰盟科技有限公司),呼吸频率60次/min,潮气量20 mL/kg,吸呼比1∶2，四肢皮下插入针形电极描记心电图,沿胸骨左缘第3、4肋间行纵向切口,剪断肋骨,破胸膜、心包膜,在左冠状动脉前降支起始部2 mm处,用6～0 丝线穿过心肌浅层,将丝线两端由一直径为1 mm的聚乙烯管中穿出,心跳稳定 15 min后抽紧线,血管钳推压小管压迫左前降支并与丝线一并夹住,阻断冠脉血流,造成心肌缺血。30 min后放松聚乙烯管和丝线,以造成再灌注损伤模型。以心电图R波高耸或ST段抬高,局部心肌出现发绀为缺血形成。放松后抬高的ST段下降1/2以上为MIRI造模成功。假手术组只在左冠状动脉前降支下穿线,不结扎,余步骤同上。各组大鼠再灌注2 h后处死，开胸，取左室前壁同一部位心肌组织，10%中性甲醛4 ℃固定24 h,常规脱水,石蜡包埋,切成厚5 μm切片。用于心肌细胞凋亡检测及免疫组化分析。
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1.4 测定指标
1.4.1 细胞凋亡指数 切片常规二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水后,严格按TUNEL试剂盒说明书操作。采用中型树胶封片,光镜下正常心肌细胞核呈蓝绿色，凋亡细胞核呈深浅不一的棕褐色。在光学显微镜下计数5个高倍视野中凋亡阳性心肌细胞核数目及其占总细胞核数目的比例,计算心肌细胞凋亡指数。
1.4.2 GRP78,caspase-12蛋白平均积分光密度 采用SABC法检测GRP78和caspase-12蛋白表达,严格按试剂说明操作。DAB显色，苏木精复染，封片镜检。镜下观察细胞质显示棕黄色为GRP78和caspase-12蛋白表达阳性。显微图像采集系统对每张免疫组化切片随机选取5个高倍视野(×400) ,利用Image.Pro Plus5.0专业图像分析软件分析阳性的平均灰度值(0～255范围内,灰度值与染色强度成反比),求出平均积分光密度(average integrate optical density,AIOD)。
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1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0处理。数据以均数±标准差(x±s)表示,组间差异采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 心肌细胞凋亡指数 心肌细胞凋亡指数，吡格列酮组为(23.2±3.4)%,缺血再灌注组为(34.5±4.9)%，假手术组为(1.6±0.4)%。吡格列酮组较缺血再灌注组低(P<0.05),但高于假手术组(P<0.05)。
2.2 GRP78蛋白平均积分光密度AIOD 吡格列酮组为0.44±0.03,缺血再灌注组为0.55±0.02 ,假手术组为0.02±0.02,吡格列酮组较缺血再灌注组低(P<0.05),但高于假手术组(P<0.05)。
2.3 Caspase-12蛋白平均积分光密度 吡格列酮组为0.54±0.03 ,缺血再灌注组为0.61±0.04 ,假手术组为0.01±0.01,吡格列酮组较缺血再灌注组低(P<0.05),但高于假手术组(P<0.05) 。
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3 讨 论
I/R造成的心肌细胞损伤有坏死和凋亡两种形式，且凋亡起着很大作用，是MIRI重要机制之一[3]。在缺血心肌再灌注早期,细胞凋亡先发生于微冠脉的内皮细胞,后呈放射状使周围的心肌细胞发生凋亡，扩大梗死范围[4]。调控细胞凋亡的3条信号转导通路中，ERS对应激细胞的损伤或凋亡有重要作用。ERS通过激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)以保护由ERS所引起的细胞损伤,恢复细胞功能,但是如果损伤太过严重,内环境稳定不能及时恢复,ERS则引起细胞凋亡。
葡萄糖调节蛋白-78 (GRP78),又称免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)，属于HSP70家族,可以结合未折叠或错误折叠蛋白质,促进新生蛋白质的正确折叠,防止未折叠、错误折叠蛋白质的聚集。在内质网应激条件下,GRP78的表达上调非常明显,因而 GRP7的诱导表达被广泛用于ERS和UPR激活的标志[5]。Zhang等[6]用ERS诱导剂TM处理心肌细胞,引起GRP78mRNA及蛋白水平明显升高,且这一处理可明显减轻ATP耗竭及氧化应激造成的心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放,增加 ER对Ca2+的摄取,提示ERS可通过诱导ER伴侣蛋白的表达增强心肌细胞抵抗 I/R损伤的能力。ERS诱导细胞凋亡有3个主要途径:CHOP通路、JNK通路、caspases通路。caspase-12 定位于内质网外膜，是介导内质网应激凋亡的关键分子。实验发现caspase-12 缺陷鼠能抵抗内质网应激引起的凋亡，而对其他死亡刺激仍可发生细胞凋亡，表明caspase-12与内质网应激介导凋亡的机制有关，而与非内质网应激介导的凋亡无关[7]。缺血预处理(isehemia preconditioning，IPC)是减轻I/R损伤的最有效方法之一，可缩小梗死范围，改善心脏功能，减少心律失常等。且预处理可明显减少凋亡细胞，预处理在一定程度上通过减少心肌细胞凋亡而减轻I/R[8]。各种不同的PPARγ激动剂TZDs都可以减少MIRI，发挥类似IPC作用。但以往实验多为内质网应激途径的CHOP通路，JNK通路，关于吡咯列酮在内质网caspases通路的实验还鲜有报道。, http://www.100md.com(姜秀萍,陈还珍,祖玉刚,杜西振)
关键词:心肌缺血再灌注;细胞凋亡;吡格列酮
中图分类号：R542.2 R329.2 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2012)01-0069-03
心肌缺血-再灌注损伤 (myocardial ischemia-reperfusion injury MIRI)是阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得最佳疗效的主要难题，无论是溶栓、介入，还是外科搭桥、心脏移植手术。I/R时心肌细胞死亡既有坏死也有凋亡,且凋亡是决定梗死面积大小的主要因素,尤其在I/R早期心肌细胞凋亡(MA)作用更为明显[1]。目前研究认为调控细胞凋亡的信号转导通路主的致细胞凋亡重要途径。研究发现噻唑烷二酮类(thiazolidinediones,TZDs)胰岛素增敏剂为过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator - activated receptor gamma，PPARγ)的高亲和配体,可减轻MIRI时心肌梗死面积,改善心功能,起抗MIRI作用,主要机制是减轻再灌注时心肌细胞的凋亡[2]。本文观察吡格列酮对内质网应激反应的影响,探讨吡格列酮在内质网应激途径对心肌的保护作用。
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1 材料与方法
1.1 动物分组 健康Wistar雄性大鼠(山西医科大学生理实验中心提供)30只，体重180 g～220 g，随机分为3组，I/R+ Pio组，灌服吡格列酮5 mg/(kg•d),溶于2 mL生理盐水中，共14 d；I/R组及假手术组，灌服生理盐水，2 mL/d，共14 d。
1.2 药品与试剂 盐酸吡格列酮片(艾可拓，日本武田药品工业株式会社生产)，GRP-78、caspace-12蛋白一抗为兔抗大鼠多克隆抗体 (北京博奥森)；二抗为羊抗兔SABC免疫组化试剂盒、TUNEL检测试剂盒(博士德公司)。
1.3 动物模型制作 乌拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉，气管插管进行呼吸机辅助呼吸(HX200动物呼吸机，成都泰盟科技有限公司),呼吸频率60次/min,潮气量20 mL/kg,吸呼比1∶2，四肢皮下插入针形电极描记心电图,沿胸骨左缘第3、4肋间行纵向切口,剪断肋骨,破胸膜、心包膜,在左冠状动脉前降支起始部2 mm处,用6～0 丝线穿过心肌浅层,将丝线两端由一直径为1 mm的聚乙烯管中穿出,心跳稳定 15 min后抽紧线,血管钳推压小管压迫左前降支并与丝线一并夹住,阻断冠脉血流,造成心肌缺血。30 min后放松聚乙烯管和丝线,以造成再灌注损伤模型。以心电图R波高耸或ST段抬高,局部心肌出现发绀为缺血形成。放松后抬高的ST段下降1/2以上为MIRI造模成功。假手术组只在左冠状动脉前降支下穿线,不结扎,余步骤同上。各组大鼠再灌注2 h后处死，开胸，取左室前壁同一部位心肌组织，10%中性甲醛4 ℃固定24 h,常规脱水,石蜡包埋,切成厚5 μm切片。用于心肌细胞凋亡检测及免疫组化分析。
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1.4 测定指标
1.4.1 细胞凋亡指数 切片常规二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水后,严格按TUNEL试剂盒说明书操作。采用中型树胶封片,光镜下正常心肌细胞核呈蓝绿色，凋亡细胞核呈深浅不一的棕褐色。在光学显微镜下计数5个高倍视野中凋亡阳性心肌细胞核数目及其占总细胞核数目的比例,计算心肌细胞凋亡指数。
1.4.2 GRP78,caspase-12蛋白平均积分光密度 采用SABC法检测GRP78和caspase-12蛋白表达,严格按试剂说明操作。DAB显色，苏木精复染，封片镜检。镜下观察细胞质显示棕黄色为GRP78和caspase-12蛋白表达阳性。显微图像采集系统对每张免疫组化切片随机选取5个高倍视野(×400) ,利用Image.Pro Plus5.0专业图像分析软件分析阳性的平均灰度值(0～255范围内,灰度值与染色强度成反比),求出平均积分光密度(average integrate optical density,AIOD)。
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1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0处理。数据以均数±标准差(x±s)表示,组间差异采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 心肌细胞凋亡指数 心肌细胞凋亡指数，吡格列酮组为(23.2±3.4)%,缺血再灌注组为(34.5±4.9)%，假手术组为(1.6±0.4)%。吡格列酮组较缺血再灌注组低(P<0.05),但高于假手术组(P<0.05)。
2.2 GRP78蛋白平均积分光密度AIOD 吡格列酮组为0.44±0.03,缺血再灌注组为0.55±0.02 ,假手术组为0.02±0.02,吡格列酮组较缺血再灌注组低(P<0.05),但高于假手术组(P<0.05)。
2.3 Caspase-12蛋白平均积分光密度 吡格列酮组为0.54±0.03 ,缺血再灌注组为0.61±0.04 ,假手术组为0.01±0.01,吡格列酮组较缺血再灌注组低(P<0.05),但高于假手术组(P<0.05) 。
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3 讨 论
I/R造成的心肌细胞损伤有坏死和凋亡两种形式，且凋亡起着很大作用，是MIRI重要机制之一[3]。在缺血心肌再灌注早期,细胞凋亡先发生于微冠脉的内皮细胞,后呈放射状使周围的心肌细胞发生凋亡，扩大梗死范围[4]。调控细胞凋亡的3条信号转导通路中，ERS对应激细胞的损伤或凋亡有重要作用。ERS通过激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)以保护由ERS所引起的细胞损伤,恢复细胞功能,但是如果损伤太过严重,内环境稳定不能及时恢复,ERS则引起细胞凋亡。
葡萄糖调节蛋白-78 (GRP78),又称免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)，属于HSP70家族,可以结合未折叠或错误折叠蛋白质,促进新生蛋白质的正确折叠,防止未折叠、错误折叠蛋白质的聚集。在内质网应激条件下,GRP78的表达上调非常明显,因而 GRP7的诱导表达被广泛用于ERS和UPR激活的标志[5]。Zhang等[6]用ERS诱导剂TM处理心肌细胞,引起GRP78mRNA及蛋白水平明显升高,且这一处理可明显减轻ATP耗竭及氧化应激造成的心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放,增加 ER对Ca2+的摄取,提示ERS可通过诱导ER伴侣蛋白的表达增强心肌细胞抵抗 I/R损伤的能力。ERS诱导细胞凋亡有3个主要途径:CHOP通路、JNK通路、caspases通路。caspase-12 定位于内质网外膜，是介导内质网应激凋亡的关键分子。实验发现caspase-12 缺陷鼠能抵抗内质网应激引起的凋亡，而对其他死亡刺激仍可发生细胞凋亡，表明caspase-12与内质网应激介导凋亡的机制有关，而与非内质网应激介导的凋亡无关[7]。缺血预处理(isehemia preconditioning，IPC)是减轻I/R损伤的最有效方法之一，可缩小梗死范围，改善心脏功能，减少心律失常等。且预处理可明显减少凋亡细胞，预处理在一定程度上通过减少心肌细胞凋亡而减轻I/R[8]。各种不同的PPARγ激动剂TZDs都可以减少MIRI，发挥类似IPC作用。但以往实验多为内质网应激途径的CHOP通路，JNK通路，关于吡咯列酮在内质网caspases通路的实验还鲜有报道。, http://www.100md.com(姜秀萍,陈还珍,祖玉刚,杜西振)