氨氯地平对ox-LDL诱导人单核巨噬细胞MMP-9表达的影响(1)
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摘要：目的 研究氨氯地平对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导健康人单核巨噬细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA及蛋白表达影响。方法 采用体外密度离心法分离健康人单核细胞培养并传至4代后，以佛波酯(40 ng/mL)诱导为巨噬细胞，培养48h后用于实验。根据实验要求分为空白对照组、ox-LDL组、不同剂量(0.1μmol/L，1μmol/L，10μmol/L)氨氯地平组。RT-PCR检测各组MMP-9 mRNA的表达情况。Elisa检测各组MMP-9蛋白的表达。结果 单核巨噬细胞经100 μg/mL ox-LDL诱导后，与空白对照组比较MMP-9 mRNA和蛋白表达显著增加；经ox-LDL诱导后不同剂量氨氯地平组与ox-LDL组比较MMP-9 mRNA和蛋白表达显著降低，并呈浓度效应依赖关系，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 ox-LDL可使人单核巨噬细胞MMP-9的表达增加，氨氯地平可呈浓度效应依赖性地减少ox-LDL诱导人单核巨噬细胞MMP-9的表达，从而在稳定斑块，减少急性冠脉事件发生中起作用。
关键词：氨氯地平；氧化低密度脂蛋白；基质金属蛋白酶-9；稳定斑块
中图分类号：R972 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2012)01-0073-02
冠状动脉粥样硬化斑块由稳定转为不稳定，继而破裂导致血栓形成，是急性冠脉综合征(ACS)最主要的发病机制[1]。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP- 9)是MMPs家族中的重要成员，是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)代谢的关键酶之一,在动脉粥样斑块处的血管重构、斑块的不稳定及破裂诱发的ACS中都起着十分重要的作用[2]。
氨氯地平(Amlodipine)是广泛用于临床的第三代新型长效二氢吡啶类钙通道阻滞剂(calcium channel blockers,CCB)，临床上主要应用于高血压治疗的一线用药。
1 材料与方法
1.1 研究对象 健康成人静脉血液来自山西医科大学第二临床医院体检中心；人淋巴细胞分离液(Lymphocytes Separation Medium1077)为上海华精生物高科技有限公司产品；RPMI-1640培养液；胎牛血清为杭州四季青公司产品；佛波酯购自美国SIGMA公司；氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)为北京协生生物科技有限公司产品；FITC-CD14抗体购自日本Beckman Coulter公司。RNA提取试剂盒(TransZol)购自北京全式金生物技术公司；逆转录-多聚酶联反应(RT-PCR)试剂盒购自北京全式金生物技术公司；引物序列由上海生工生物有限公司合成；酶联免疫(ELISA)试剂盒购自美国R＆D公司；氨氯地平为辉瑞公司馈赠。
1.2 巨噬细胞分离、培养、诱导和鉴定 取肝素抗凝静脉血30 mL分装到10个离心管，用RPMI-1640液稀释1倍并充分混匀，分别缓慢加入等比例淋巴细胞分离液于离心管中，2000 r/min离心20 min后，吸取中间环状云雾状淋巴细胞层，再以3 mLPBS液充分混匀，1 500 r/min离心洗涤2次；用含10%胎牛血清的RPMI-1640各5 mL将细胞吹开混匀，取细胞悬液至培养瓶，每瓶4 mL，于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，培养至4代后于细胞指数生长期进行诱导转化实验。诱导转化时，以40 ng/mL的PAM无胎牛血清RPMI-1640培养液继续培养48h～72 h，待细胞转化为巨噬细胞后以RPMI-1640培养液洗涤3次，置于10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中继续培养48 h。台盼蓝染色法测定细胞存活率。用特异性荧光素标记的CD14细胞表面抗体行流式细胞术进行单核细胞源性巨噬细胞鉴定。
1.3 试验分组 试验共分5个组。空白对照组，不进行任何干预，仅单独培养单核巨噬细胞24h；ox-LDL对照组，只加入ox-LDL 100 mg/mL孵育24 h；试验三组分别加入100 mg/mL ox-LDL孵育2 h后，再分别加入氨氯地平低剂量0.1 μmol/L;中剂量1.0 μmol/L;高剂量10.0 μmol/L培养24 h。
1.4 半定量RT-PCR检测MMP-9mRNA的表达水平
1.4.1 RNA提取 弃培养瓶中的培养液，每瓶加入1.0mLTrizol，依次加入氯仿、异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤后略晾干，溶于25 μL DEPC中。核酸紫外分析仪检测，根据260/280比值，所有样品A260/A280比值1.9~2.0。并根据260 nm 的吸光度值对样品的总RNA进行初步定量,确定样品中RNA纯度和含量。
1.4.2 反转录反应 反转录反应在20 μL体系中进行：含1 μg RNA，20 mg/L的oligo(dT)引物，1.0 mml/L dNTP，20 U Rnase抑制剂，1×Buffer，200UM-MLV反转录酶。于PCR仪上42 ℃反应1 h，72℃灭活10 min后保存于-20 ℃冰箱中。
1.4.3 PCR扩增反应 MMP-9上游引物序列为：5′-TCCCTGGAGACCTGAGAACC-3′；下游引物序列为：5′-GGCAAGTCTTCCGAGTAGTTT-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循环29次；末次延伸7 min，产物长度为307 bp。B-actin上游引物序列：5′-CCTGAGGCACTCTTCCAG-3′,下游引物序列：5′-TCACACTTCATGATGGA-3′,产物大小100 bp ......
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