Exendin4通过抗氧化应激减轻糖尿病心肌病心肌纤维化的实验研究
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摘要:目的 探讨Exendin4对糖尿病心肌病(DCM)大鼠心肌纤维化的作用。方法 高热量饮食加小剂量链脲佐菌素注射建立2型糖尿病大鼠模型。成模大鼠随机分为糖尿病心肌病组(DCM组)和大、小剂量Exendin4干预组(DI组),另设正常对照组(NC组)。治疗6周后测各组血脂、免疫组化法检测心肌血红素加氧酶1(HO1)、基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达、Masson染色测心肌胶原含量。结果 与NC组相比,DCM组HO1的表达甚少,DCM大鼠MMP9的表达明显升高,心肌组织胶原含量明显升高,心肌间质纤维化,Exendin4治疗后,HO1的表达增强,MMP9表达减少，心肌纤维化减轻。结论 Exendin4通过抗氧化应激在逆转DCM心肌纤维化过程中起着重要的作用。
关键词:心肌纤维化；糖尿病心肌病；Exendin4；氧化应激
中图分类号：R587.1 R255.4 文献标识码：A 文章编号：16721349(2012)02019302
糖尿病心肌病(DCM)是一种特异性心肌病,病理表现为心肌肥厚和心肌纤维化,其发病机制尚未完全明了,研究表明高血糖导致活性氧代谢产物(ROS)的增多、氧化应激增强激活基质金属蛋白酶(MMPs)，进而引起心肌纤维化在其发病过程中起着关键作用[1,2]。Hisko等[3]指出, 胰高血糖素样肽1(GLP1)能够通过激酶A(PKA)的激活减少活性氧的产生。Exendin4是一种从蜥蜴毒液中分离出的含39个氨基酸的多肽。研究表明,在哺乳动物体内Exendin4与GLP1有相同的生理功能。本研究观察Exendin4能否改善糖尿病心肌纤维化,以及这种效应是否通过抗氧化应激实现。
1 资料与方法
1.1 实验动物 38只清洁Wistar雄性大鼠,6周龄,体质量180 g～220 g,自由进食、水。
1.2 大鼠DCM模型的建立 随机选取8只作为正常对照组(NC组)给予常规饲料,其余30只给予高糖高脂饲料(10%猪油、20%蔗糖、2%胆固醇、1%胆盐、67%常规饲料),4周后腹腔注射40 mg/kg链脲佐菌素(STZ， Sigma公司,溶于0.1 mol/L,pH4.2的枸橼酸缓冲液中)。对照组仅腹腔内注射等量的枸橼酸缓冲液。2周后血糖≥16.7 mmol/L的大鼠为糖尿病模型。26只大鼠符合2型糖尿病标准,随机分为Exendin4低剂量组(8只)、Exendin4高剂量组(8只)、DCM组(10只)、Exendin4低剂量组、Exendin4高剂量组分别给予Exendin4 4 μg/kg、20 μg/kg每日皮下注射,治疗6周。DCM组仅给予高脂高糖饲料。
1.3 血标本的获取及观察指标 实验结束时以20%乌拉坦溶液4 mL/kg腹腔注射麻醉,剖杀大鼠,心房内取血,离心分离血清,检测胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)。
1.4 组织标本的制备及观察指标 迅速取出心脏,在冰盐水中冲洗干净,滤纸吸去多余水分。在左心室中部留取小块组织,放入100 g/L中性甲醛液内,24 h后石蜡包埋。免疫组织化学分析采用SP染色试剂盒,所用抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。石蜡切片常规脱蜡至水,30 g/L过氧化氢孵育10 min消除内源性过氧化物酶的活性,蒸馏水冲洗,PBS浸泡 5 min,高压热修复抗原,按试剂盒所介绍的方法分别检测基质金属蛋白酶9(MMP9)、血红素加氧酶1(HO1)的表达情况,使用高清晰度彩色医学图文分析系统的灰度定量法进行半定量分析。
1.5 HE、Masson染色 取少许左心室肌组织石蜡切片,行HE、Masson染色,光镜下观察心肌细胞呈红色,胶原纤维呈蓝绿色,拍片,采用图像分析仪定量心肌组织胶原的含量。
1.6 统计学处理 采用 SPSS13.0行Oneway ANOVA方差分析。
2 结 果
2.1 一般状况 糖尿病大鼠多食、多饮、体质量明显减轻,血糖水平升高,符合2型糖尿病的诊断标准;DCM组有2只大鼠死亡,可能死于感染或糖尿病并发症。
2.2 血脂指标比较 低剂量组和高剂量组均导致三酰甘油和低密度脂蛋白的降低,二者降低水平差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。
2.3 大鼠心肌HO1、MMP9的表达水平 与NC组相比,DCM组HO1的表达甚少,治疗后表达明显增加,大剂量组较显著; DCM大鼠MMP9的表达明显升高,心肌组织胶原含量明显升高,心肌间质纤维化,Exendin4治疗后,MMP9表达减少，心肌纤维化减轻,大剂量治疗组较显著。详见表 2。
2.4 心脏病理变化 HE染色NC组大鼠心脏结构未见异常；DCM组心肌纤维排列紊乱、间隙增宽,细胞核大小不一、凋亡细胞核增多；Exendin4治疗后病理损伤明显减轻,其中高剂量组减轻更明显。Masson染色DCM组心脏胶原含量较NC组明显增高(P<0.05),Exendin4治疗后胶原含量明显降低,其中高剂量组减轻更明显(P<0.05)。详见表 2。
3 讨 论
糖尿病心肌病是糖尿病的重要并发症之一。本研究以高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素注射建立的动物模型,在实验早期就出现多饮、多食、多尿等糖尿病的临床表现。12周时心肌病理结果显示心肌细胞排列紊乱、大量胶原纤维分布,提示本研究成功建立了2型糖尿病心肌病动物模型。
氧化应激损伤在糖尿病心肌纤维化的发生、发展中的作用越来越受到关注。血红素加氧酶1是体内参与亚铁血红素代谢的一种具有多种功能的微粒体氧化酶,在氧化应激过程中起重要的细胞保护作用[4]。它能有效地清除ROS并抑制脂质过氧化[4],此外还可使细胞外超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的表达量增加来对抗氧化应激[5]。
本研究显示,糖尿病组大鼠HO1的表达明显降低,提示糖尿病大鼠抗氧化能明显降低；经过Exendin4的干预后,HO1的表达较DCM组明显升高,提示Exendin4可以提高DCM大鼠抗氧化能力,这与NoyanAshraf等[6]的研究结果一致。高剂量组HO1升高更加显著,提示抗氧化能力的强弱与剂量相关。同时,糖尿病组大鼠心肌MMP9的表达明显增加,间质纤维化重,Exendin4干预后心脏结构损伤明显减轻,间质纤维化减轻,高剂量组减轻更加显著,推测Exendin4在改善DCM氧化应激损伤及心肌纤维化方面起着重要作用。
总之,氧化应激损伤在DCM的发生与发展中占有重要作用,Exendin4通过提高糖尿病大鼠心肌抗氧化物质HO1的含量减弱氧化应激损伤,减轻心脏纤维化,对DCM有一定的防治作用。
参考文献:
[1] Solini A,Santini E,Nannipieri M,et al.High glucose and homocysteine synergistically affect the metalloproteinases tissue inhibitors of metalloproteinases pattern,but not TGFB expression,in human fibroblasts[J] ......
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