软脂酸制备3T3L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的方法(1)
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摘要：目的 用软脂酸(PA)诱导3T3L1脂肪细胞，探讨用PA制备3T3L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)模型的方法。方法 将3T3L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞，用油红O染色法鉴定细胞。用不同浓度的PA(0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L)干预3T3L1脂肪细胞24 h，收集各组细胞培养液，用葡萄糖氧化酶法测定各组细胞培养液葡萄糖的含量，观察PA对3T3L1脂肪细胞糖摄取的影响。结果 0.25 mmol/L PA就可明显抑制成熟的3T3L1脂肪细胞葡萄糖的摄取(P<0.01)，且呈浓度依赖性。与对照组相比，0.25 mmol/L PA组、0.5 mmol/L PA组、1.0 mmol/L PA组葡萄糖摄取率分别下降5.25%、10.29%、14.54%。结论 在胰岛素刺激下，0.25 mmol/L PA作用于3T3L1脂肪细胞24 h就可诱导细胞产生IR，且随着浓度的增加其效果逐渐增强。
关键词：3T3L1脂肪细胞；胰岛素抵抗；软脂酸
中图分类号：R587 R255.4 文献标识码：A 文章编号：16721349(2012)02019702
胰岛素抵抗(IR)是胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感性下降，即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种代谢状态。胰岛素与细胞表面受体的结合或胰岛素信号在胞内的传递过程中，任何一个信号转导环节受到抑制均有可能引起IR[1]。研究表明在肥胖者体内血浆游离脂肪酸(FFA)的水平是增高的[2]，血浆高水平的FFA显著影响外周组织细胞，特别是脂肪细胞对胰岛素的敏感性，使脂肪细胞糖代谢功能障碍，导致IR[3]。因此，FFA在IR发病过程中的作用已成为近年来研究的热点，但用FFA制备体外细胞IR模型无论方法还是剂量目前还未达成共识。软脂酸(PA)是FFA的一种，本实验旨在探讨用PA制备3T3L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)模型的方法。
1 材料与方法
1.1 实验试剂 3T3L1前脂肪细胞株由山西医科大学第一医院内分泌实验室冻存。高糖DMEM培养基购自GibcoBRL(公司；胎牛血清(FCS)购自杭州四季青生物有限公司；3异丁基1甲级黄嘌呤(IBMX)、甲状腺素(T4)、不含游离脂肪酸的BSA(FAF BSA)、牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亚砜(DMSO)、PA均购自Sigma公司；葡萄糖测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及诱导分化 参考文献[4]的方法进行3T3L1前脂肪细胞的培养及诱导分化操作：在37 ℃、5%CO2的条件下，3T3L1前脂肪细胞在含有10%FCS的高糖DMEM中培养，待细胞融合2 d后，加入含有0.5 mmol/L IBMX、0.25 μmol/L地塞米松、0.2 nmol/L甲状腺素、250 nmol/L胰岛素和10%FCS的高糖DMEM培养4 d，期间换液1次，然后换上含有0.25 μmol/L地塞米松、0.2 nmol/L甲状腺素、250 nmol/L胰岛素和10%FCS的高糖DMEM培养，2 d换液1次，诱导分化8 d～12 d的3T3L1前脂肪细胞90%～95%呈脂肪细胞表型。用油红O染色鉴定[5]，细胞可用于实验。
1.2.2 油红O染色鉴定3T3L1脂肪细胞 油红O是一种可以特异地和细胞内三酰甘油结合的红色染料，与未分化细胞和细胞外脂质不结合。步骤如下:吸弃培养板里的分化培养基；1×PBS冲洗细胞2次或3次；加入10%的甲醛磷酸盐缓冲液4 mL/孔，室温固定1 h；吸弃固定液；加入油红O溶液，室温染色3 h；吸弃染色剂；无菌三蒸水冲洗2次，洗去未着色染料；显微镜下观察，照相。
1.2.3 不同浓度的PA干预3T3L1脂肪细胞 参考文献[6]的方法溶解PA。将3T3L1前脂肪细胞接种于6孔板，诱导分化成熟后，换上含有0.2%的FAF BSA的高糖DMEN无血清培养基过夜。依据PA不同浓度分为0 mmol/L PA组(对照组)、0.25 mmol/L PA组、0.5 mmol/L PA组、1.0mmol/L PA组共4组，每组3孔，分别换上含0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0mmol/L PA及1%FAF BSA的高糖DMEN培养24 h，收集各组细胞培养液，用葡萄糖氧化酶法测定各组细胞培养液葡萄糖的含量。每组实验重复3次。
1.2.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件包进行分析，数据以均数±标准差(x±s)表示,各组间的比较采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 3T3L1脂肪细胞油红O染色鉴定 光镜下，3T3L1前脂肪细胞形态与成纤维细胞相似，呈长梭型，细胞内没有脂肪积聚，油红O染色后细胞不着色。诱导分化后，细胞变圆、变亮，细胞质中逐渐出现大量圆形的脂肪滴。诱导分化8 d后，90%以上的细胞呈脂肪细胞表型，胞浆中积聚大量脂滴。油红O染色后，可见细胞质内脂肪滴被染成红色。
2.2 PA对3T3L1脂肪细胞葡萄糖转运的影响 在100 nmol/L INS的作用下，不同浓度的PA作用于3T3L1脂肪细胞，0.25 mmol/L PA组、 0.5 mmol/L PA组、1.0 mmol/L PA组细胞培养液中葡萄糖浓度均显著高于对照组(P<0.01)，0.5 mmol/L PA组较0.25 mmol/L PA组显著升高(P<0.01)，1.0 mmol/L PA组较0.5 mmol/L PA组显著升高(P<0.01)。详
与对照组比较，1) P<0.01；与0.25 mmol/L PA组比较，2) P<0.01；与0.5 mmol/L PA组比较，3) P<0.01
3 讨 论
FFA导致IR的主要机制有：抑制糖代谢中的相关酶，如丙酮酸脱氢酶、磷酸果糖激酶等，抑制糖摄取[7]；长期高FFA可使骨骼肌及脂肪细胞GLUT4 mRNA及蛋白水平减少，并使其转位减少，导致葡萄糖转运障碍[8,9]；在长期高FFA的刺激下 ......
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