丹星通络汤治疗大鼠脑缺血再灌注Bax蛋白表达的影响(2)
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参见附件。
1.2.4 HE染色 切片常规脱蜡，苏木素及伊红染色，脱水、透明、封片，光镜下观察。
1.2.5 免疫组织化学染色及检测Bax蛋白表达 采用SP法切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢孵育15 min,PBS洗5 min×3次，热修复抗原15 min；滴加1∶100稀释的Bax一抗，4 ℃冰箱过夜，PBS洗5 min×3次；滴加二抗，37 ℃孵育20 min；PBS洗5 min×3次，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。每张切片于400倍光镜下采集10个具有代表性以缺血侧海马区为主的互不重叠视野，应用图像分析软件测量每个视野的平均光密度(OD)值。以OD值大小反映蛋白表达的多少。
1.3 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件进行统计，所有数据以均数±标准差(x±s)表示，计量资料采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法。
2 结 果
2.1 HE染色 假手术组大鼠脑组织结构正常，海马神经元呈圆形或卵圆形，胞体较大，染色质分布均匀，核仁明显。模型组大脑皮层及海马椎体层的神经细胞间隙增宽，海马区神经元明显变性，胞体肿胀，胞浆透亮，呈空泡样变化，嗜酸性染色减弱，核固缩，核溶解，核体不规则，周边可见中性粒细胞浸润，胶质细胞数量增多。各用药组海马区也可见神经元变性，核固缩，核溶解，但数量明显少于模型组，且呈剂量依赖性，丹星通络汤大剂量组及尼莫地平组改善最为显著。
2.2 大鼠脑组织海马区Bax蛋白的表达 显微镜下观察胞质中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。假手术组Bax蛋白表达很弱；模型组Bax阳性细胞分布不均匀，在海马区较密集，胞质着色很深，蛋白表达较假手术组明显增强，丹星通络汤大、小剂量组以及尼莫地平组Bax蛋白的表达较模型组明显降低。
2.3 大鼠脑组织海马区Bax蛋白的OD值 假手术组Bax蛋白平均光密度(OD)值表达微弱；脑缺血2 h,再灌注24 h后，Bax蛋白的表达较假手术组明显增强(P<0.01)；假手术组Bax蛋白的表达与其他组比较也有统计学意义(P<0.01)；尼莫地平组、丹星通络汤小剂量组、丹星通络汤大剂量组与模型组比较有统计学意义(P<0.05)；丹星通络汤大剂量组与尼莫地平组、丹星通络汤小剂量组比较有统计学意义(P<0.05)。详见表1。
3 讨 论
近年来，随着生活水平的不断提高，缺血性脑血管疾病已经成为了临床的常见病之一。恢复缺血区供血成为了临床治疗的目标。但是多种脑缺血模型显示，恢复血供再灌注之后，脑组织损伤将进一步加重，其发生机制尚未阐明，目前认为脑缺血再灌注损伤后可能引起能量衰竭和酸中毒，产生大量自由基、兴奋性氨基酸、磷脂代谢异常、积聚，并引起离子自紊机制破坏，导致细胞内钙超载，最终引起某些原癌基因的表达，诱导凋亡的发生[3]。凋亡是机体维持自身稳定和适应环境必需的生理过程，但凋亡异常增加则是某些损伤因素导致细胞死亡的主要形式[46]。1993年时在人体B细胞基因文库发现了一种新基因，它是由192个氨基酸残基组成、相对分子质量为210 00的蛋白质。在胞质中的Bax一般以单体形式存在，然而在细胞发生凋亡时，与线粒体关联的Bax既能以无活性的单体形式存在，也能以与线粒体膜结合的大分子量的活性复合物形式存在。当细胞受到死亡信号刺激后，Bax发生构象变化，从胞浆中转位至线粒体外膜，与抗凋亡蛋白相互作用，引起线粒体膜通透性改变，释放CytC，与凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf1)结合，引起Apaf1寡聚，顺序激活Caspase9、Caspase3，最终导致细胞凋亡[7]。因此脑缺血后，若能及时采取脑保护措施，抑制死亡基因的作用，加强存活基因的功能，将为脑缺血的预防和治疗开辟新的道路[8]。
丹星通络汤主要针对脑缺血急性期痰浊与瘀血互结的原理，以丹参、胆南星为主，活血清热、祛痰开窍；黄芪补气活血，三七、红花活血通络；大黄、黄芩、白术、槐花、元参通腑滋阴泻热，标本兼顾以达活血通络、逐瘀泄热之功效。作为中药复方，合理配伍，具有多靶点，副反应小，疗效较好的特点，对患者的预后有很大改善。本实验研究发现，脑组织海马区Bax蛋白的表达模型组明显高于假手术组，而在丹星通络汤大、小剂量组较模型组明显降低；HE染色结果显示，丹星通络汤组可明显减少呈凋亡的病理学改变的神经元的数量。
丹星通络汤可能通过下调Bax蛋白的表达来抑制脑缺血再灌注损伤细胞的凋亡，从而达到预防及治疗的作用。这也为中医治疗脑中风疾病提供了理论依据。
参考文献：
[1] Oltvai ZN,Milliman CI,Korsmeyer SJ.Bcl2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog,Bax,that accelerates programmed cell death[J].Cell,1993,74(4):609619.
[2] Longa EZ,Weistein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989,20(1):8491.
[3] Charriaut MC,Remolleau S,Aggoun ZD,et al.Apoptosis and programmed cell death:A role in cerebral ischemia[J].Bio Pham,1998,52(6):264269.
[4] Shimizu S,Narita M,Tsujimoto Y.Bcl2 family proteins regulate the release of apoptogenic cytochrome C by the mitochondriam channel VDAC[J] ......
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