绞股蓝皂甙对Aβ诱导AD细胞模型的影响(2)
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参见附件。
(iNOS)的表达和凋亡，观察SLs对Aβ140诱导胆碱能神经元损伤的影响，为SLs用于临床防治AD提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 孕15 d～16 d SD大鼠2只，由湖北医药学院实验动物中心[许可证号：SCXK(鄂)20050008]提供。SLs购自上海亿欣生物科技有限公司，脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)购自美国Promage公司。大鼠Aβ140、多聚赖氨酸、胰蛋白酶均购自美国Sigma公司。Annexin VFITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自武汉天源生物科技司，兔抗人胆碱乙酰转移酶抗体(rabbit antihuman choline acetyltransferase，ChAT Antibody)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOS)一抗、SABC试剂盒、胎牛血清、DMEM购自美国Gibco公司。
1.2 方法
1.2.1 基底前脑神经元培养 孕15 d～16 d SD大鼠2只，无菌条件下，取胚鼠基底前脑原基，小心剥除软脑膜，用眼科剪将其剪成小碎块，并向其中加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃水平摇床消化5 min。用含血清的培养基(高糖EMEM+2 mmol/L谷氨酰胺+0.1U/mL胰岛素+10%FBS)阻止消化，吹打混匀，1 000 r/min离心10 min；去上清，用含血清完全培养基(含B27，2%，V/V)重悬细胞，200目尼龙网过滤；细胞计数后，制成密度为1×106/mL细胞悬液，接种于预先包被多聚赖氨酸的96孔板，每孔1.0×105个细胞，在37 ℃含5%CO2和95%空气的细胞培养箱中培养。0.5 h、24 h各换1次培养液，第3天添加阿糖胞苷(4 mg/L)，之后每隔3 d换液1次。
1.2.2 建立AD细胞模型 将Aβ140溶于无菌生理盐水(5μg/mL)，放入37 ℃温箱孵育2周，使其变成丝状聚集状态。接种后第4天将细胞分为6组：空白对照组、BDNF组、SLs组、Aβ140组、Aβ140+BDNF组和Aβ140+SLs组，每组设16个复孔。换液时，BDNF组、Aβ140+BDNF组加入BDNF，终浓度为100 μg/L；SLs组、Aβ140+SLs组培养液中加入SLs，终浓度400 μg/mL[5]；Aβ140组、Aβ140+BDNF组和Aβ140+SLs组均加入Aβ140，终浓度为10 μg/mL；空白对照组加入等量培养液。
1.2.3 MTT比色试验检测各组细胞活性 各干预因子作用48 h后对各组细胞进行MTT比色试验。各组每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，继续培养4 h，吸弃孔内培养液，每孔加200 L DMSO溶液终止反应，温和振荡10 min，使蓝紫色结晶充分溶解；然后在酶标仪上波长为570 nm检测细胞积分吸光度(integral absorbance，IA)，以IA值间接反映细胞存活数量及其功能状态。
1.2.4 各组ChAT免疫阳性细胞数观察 重新接种细胞于多聚赖氨酸包被的圆形盖玻片，置入24孔板爬片，各干预因子作用48 h后，结合SABC试剂盒说明，对各组细胞进行ChAT免疫细胞化学染色。常规清洗各组细胞，用4%多聚甲醛固定10 min，封闭，分别加入一抗ChAT抗体，置4 ℃冰箱过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗IgG (1∶75)室温孵育30 min，DAB显色，乙醇脱水，二甲苯透明，封片观察。阴性对照用抗体稀释液代替一抗作用，未见明显的细胞着色。倒置显微镜下观察并进行ChAT免疫反应阳性神经元计数。
1.2.5 各组神经元iNOS阳性表达的观察 各干预因子作用48 h后，采用SABC法进行iNOS免疫细胞化学染色：分别加入一抗iNOS抗体，4 ℃摇床上孵育过夜；二抗为生物素化的羊抗兔Ig G(1∶100)，室温摇床上孵育1.5 h； ABC液室温摇床上孵育1.5 h；DAB显色，常规脱水、透明、封片。Olympus显微镜观察并计数视野中iNOS免疫反应阳性神经元数量。iNOS免疫细胞化学染色替代对照实验：用0.1 mol PBS取代iNOS抗体，结果为阴性。
1.2.6 各组神经元凋亡检测 各干预因子作用48 h后，参照试剂盒说明进行AnnexinVFITC/PI双染色流式细胞仪检测细胞的早期凋亡率。各组细胞培养于25cm2细胞培养瓶，用1.25 g/L胰酶+0.2 g/L EDTA消化并收集到10 mL离心管中，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×106个/mL,取1 mL细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL冷PBS重悬细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，细胞重悬于250 μL结合缓冲液，加入10 μL Annexin VFITC和5 μL PI，轻轻混匀，室温避光反应15 min，加入250 μL结合缓冲液，立即进行流式细胞仪检测，数据由软件收集和分析。相同方法重复检测5次。
1.2.7 统计学处理 光镜下阳性细胞计数：计数每张10个随机视野中免疫反应阳性神经元数后取平均值作为计数结果，5张玻片计数结果取平均值为最后结果。实验测定值采用均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS13.0统计软件进行分析。对检测结果进行方差分析，两两比较采用SNK检验。
2 结 果
2.1 SLs对培养细胞生长的影响 接种后24 h培养的神经元均已贴壁，多呈圆形，体积小，立体感强，彼此分散，细胞突起不明显。培养3 d后，神经元生长良好，形态多样，从多极到梭形，胞体饱满，细胞间突起联系广泛。各干预因子作用48 h后，空白对照组细胞数目少，突起较细；BDNF组、SLs组细胞数目相对增多，胞体增大，突起明显增粗、延长、分支多，相邻细胞突触相互连接成网；Aβ140组较空白对照组细胞数目少，部分细胞皱缩，突起明显变细、变短、分支少，相邻细胞间突触减少、相互连接稀疏；Aβ140+BDNF组和Aβ140+SLs组神经元生长状况较Aβ140组明显好转 ......
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