Exendin4干预对糖尿病肾病大鼠肾脏TGFβ-1mRNA和蛋白表达的影响(1)
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摘要：目的 通过Exendin4对糖尿病肾病(DN)大鼠进行干预治疗，观察其对肾组织转化生长因子1(TGFβ-1)mRNA和蛋白表达的影响。方法 用高糖高脂饲料结合小剂量的链尿佐菌素建立糖尿病肾病模型，随机分为糖尿病肾病模型组、Exendin4低剂量治疗组[4 μg/(kg•d)]和Exendin4高剂量治疗组[20 μg/(kg•d)]，治疗6周后测定各组大鼠24 h蛋白尿、血糖、血脂，HE染色光镜下观察肾组织的病理变化，用免疫组化法及RTPCR两种方法检测TGFβ-1的表达。结果 与糖尿病肾病模型组相比，Exendin4治疗组的血糖、血脂、24 h尿蛋白定量均下降(P<0.05),高剂量治疗组改善更明显(P<0.05)。与糖尿病肾病模型组相比，Exendin4治疗组大鼠肾组织的TGFβ-1表达明显下降(P<0.05),高剂量治疗组大鼠肾组织的TGFβ-1表达下降更明显(P<0.05)。结论 Exendin4对糖尿病肾病大鼠具有一定的肾脏保护作用，且有剂量依赖性，其机制可能与降低TGFβ-1mRNA和蛋白的表达进而抑制细胞外基质的堆积有关。
关键词：Exendin4；糖尿病肾病；大鼠；转化生长因子
中图分类号：R587.1 R255.4 文献标识码：A 文章编号：16721349(2012)02020403
糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病( diabetes mellitus，DM) 患者进行肾移植和终末期肾衰竭最常见的原因，主要病理特点是系膜区大量基质堆积致肾小球、肾小管基底膜增厚,最终导致肾小球硬化，肾小管间质纤维化，肾功能丧失。目前研究认为肾组织转化生长因子1(TGFβ-1)是具有独特致纤维化的细胞因子, 其水平增高可使细胞外基质成分重构和合成增多，肾小球、肾小管基底膜增厚而导致肾功能改变。故认为抑制TGFβ-1的过高表达及作用途径可预防或延缓糖尿病肾病的发生发展。Exendin4由于能平稳降低血糖的同时具有减轻体重,调节脂代谢紊乱等作用,成为治疗2型糖尿病的新型药物,但其对糖尿病所致肾脏病变的作用研究较少。本文通过Exendin4对糖尿病肾病大鼠肾脏组织TGFβ-1mRNA和蛋白表达的影响,探讨Exendin4对糖尿病所致的肾脏损害的保护作用及可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料 健康雌性SD大鼠30只(山西医科大学生理实验室提供),体重180 g～200 g。链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ,美国Sigma 公司),Exendin4针剂(东莞宝丽健生物工程研究开发有限公司提供),尿蛋白(ALB)测定试剂盒(南京建成公司),兔抗大鼠TGFβ-1多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，DAB试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，血糖仪及试纸(美国强生公司),723可见分光光度仪(山东高密彩虹分析仪有限公司)，贝克曼2000型全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)，B22000医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 2型糖尿病肾病模型的建立和实验分组 30只SD大鼠均以高糖高脂饲料(常规饲料66.5%，10%猪油，20%蔗糖，2.5%胆固醇，1.0%胆酸盐)喂养4周后，一次性腹腔注射40 mg/kg链脲佐菌素，于注射后1周尾静脉采血测随机血糖16.65 mol/L者为糖尿病模型成功。造模过程中所有大鼠均不使用胰岛素，4周后测定血糖、24 h尿蛋白定量。若随机血糖>16.67 mmol/L、24 h 尿微量白蛋白>30 mg/(kg•d)，确定糖尿病肾病模型成立[1]。实验过程中死亡2只，造模不成功4只，余24只随机分为糖尿病肾病模型组(DN)、Exendin4低剂量治疗组(EL)、Exendin4高剂量治疗组(EH)，每组8只。
1.2.2 给药方法 糖尿病肾病模型成功后第2天，低剂量治疗组、高剂量治疗组分别给予Exedin4 4μg/(kg•d)、20μg/(kg•d)皮下注射,糖尿病肾病模型组1.5 mL/(180 g•d)皮下注射，共6周，每周测体重1次，依体重调整药物剂量。
1.2.3 标本收集 给药6周后，用代谢笼收集24 h尿液，留取少量标本测24 h尿蛋白，处死前尾静脉采血测空腹血糖(FBS)，测体重，用乌拉坦0.4 mg/kg腹腔麻醉，腹腔静脉采血，并离心后留取标本测血三酰甘油(TC)、胆固醇(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)。取双侧肾脏，左肾置于10%中性甲醛中固定，用于光镜及免疫组化研究，另一肾脏标本放于-70 ℃冰箱中保存用于RTPCR研究。
1.2.4 生化指标测定 尿蛋白测定采取分光光度仪检测，血糖由强生血糖仪及试纸检测，TC、TG、LDL、HDL由自动生化分析仪检测。
1.2.5 肾组织病理学观察 肾组织经中性甲醛固定，常规石蜡包埋，切片行HE染色，光镜下观察肾组织的形态学改变。
1.2.6 免疫组化检测TGFβ-1蛋白表达 肾组织经中性甲醛固定，常规石蜡包埋切片2 μm,70 ℃烤箱烤片1 h,后脱蜡至水，3%双氧水灭活内源性过氧化物酶15 min,PBS缓冲液冲洗2 min×3次，柠檬酸盐缓冲液进行抗原高压热修复2 min，PBS缓冲液冲洗2 min×3次，取封闭液室温下封闭10 min，滴加兔抗大鼠TGFβ-1(1∶100)抗体，37 ℃孵育2 h,取出后室温下10 min, PBS缓冲液冲洗2 min×3次，滴加聚合HRP标记抗兔IgG, 37 ℃孵育30 min, PBS缓冲液冲洗2 min×3次，DAB室温下显色，苏木素轻度复染、脱水、封片、观察。采用B22000医学图像分析系统测定每个视野中免疫组化阳性表达的光密度值，然后计算平均值。
1.2.7 RTPCR法检测TGFβ-1mRNA表达 每个样品取肾组织约50 mg,按照经典方法用Trizol试剂、氯仿和异丙醇进行抽提总RNA ......
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