重组人生长激素对癫痫持续状态大鼠神经元凋亡及XIAP、Caspase-3表达的影响
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摘要：目的 探讨重组人生长激素对大鼠在癫痫持续状态(SE)后海马神经元凋亡的影响及其可能作用机制。方法 将大鼠随机分成对照组、模型组和重组人生长激素组。采用免疫组化法对氯化锂毛果芸香碱(匹罗卡品)诱发癫痫大鼠模型脑内XIAP、Caspase3及TUNEL阳性细胞的表达进行测定。结果 模型组海马区TUNEL、XIAP、Caspase3较对照组明显增多(P<0.05)；重组人生长激素组TUNEL、Caspase3较模型组明显减少(P<0.05)，而XIAP较模型组显著增加(P<0.05)。结论 重组人生长激素可能通过促进XIAP生成进而抑制Caspase3表达，从而起到保护神经元的作用。
关键词：重组人生长激素；癫痫持续状态；XIAP；Caspase3；凋亡
中图分类号：R742.1 文献标识码：A 文章编号：16721349(2012)02020702
癫痫持续状态(SE)是常见的临床急症，是细胞层面的自身失控性发作。国际癫痫组织定义为癫痫连续发作之间意识未完全恢复又频繁再发，或发作持续30 min以上不自行停止。癫痫连续发作30 min后，海马神经元开始死亡[1]。细胞凋亡是SE后脑神经元死亡的形式之一,在SE后脑神经元死亡过程中扮演重要角色。近年来,一些研究表明，生长激素(GH)能改善大脑缺血缺氧引起的损伤,抑制细胞凋亡,促进细胞存活等作用[2,3]。本实验通过应用重组人生长激素(rhGH)观察大鼠SE后大鼠脑组织凋亡相关基因XIAP、Caspase3的表达情况,探讨rhGH干预对SE导致的神经元损伤的影响及其可能机制,以期为rhGH应用于临床SE的治疗提供动物实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 健康成年雄性Wistar大鼠54只,鼠龄3个月～4个月，体重180 g～240 g，山西医科大实验动物中心提供。重组人生长激素注射液由长春金赛药业有限责任公司生产;匹罗卡品购自美国Sigma公司；兔抗鼠XIAP多克隆抗体、兔抗鼠Caspase3多克隆抗体、TUNEL试剂盒、即用型SABC 试剂盒均系武汉博士德公司提供；氯化锂购自中国医药集团上海试剂公司；DAB 试剂由北京中杉金桥生物技术有限公司出品；余均为市售分析纯品。
1.2 动物分组及模型的建立 选用健康成年雄性Wistar大鼠54只，随机分为对照组6只，模型组、rhGH组各24只。模型组、rhGH组再分为4个亚组，每个亚组6只，分别对应癫痫持续状态后6 h、12 h、24 h和48 h四个时间点。rhGH组颈部皮下注射重组人生长激素0.1 U/(kg•d), 对照组、模型组颈部皮下注射等容积生理盐水。持续一周，1次/ 24 h。注射5 d后，除对照组外,其余各组均腹腔注射氯化锂127 mg/kg,18 h后再腹腔注射新鲜配制的毛果芸香碱(匹罗卡品)30 mg/kg,对照组给予等容积生理盐水腹腔注射。观察大鼠出现癫痫发作的时间和行为表现，痫性发作持续超过30 min为SE。在SE达1 h时,腹腔注射地西泮10 mg/kg,终止痫性发作。在癫痫持续状态后6 h、12 h、24 h和48 h分别断头取脑，对大鼠海马组织进行研究，进行各指标的检测。惊厥评分采用Racine评分法,出现3级以上发作提示造模成功,造模过程中大鼠出现死亡或不符合模型要求者,予以剔除并随机补充,以保证每组动物6只。
1.3 标本处理 各相应时间点大鼠用25%乌拉坦4 mL/kg深麻醉后,断头取脑,大鼠脑组织置入4%多聚甲醛中固定,常规脱水、透明、浸蜡、包埋后,在视交叉后海马区连续冠状切片,片厚5 μm,每隔15张连续取4张,相邻切片分为四套,分别进行各指标的检测。HE染色,光镜下观察形态学变化。
1.4 细胞凋亡检测 采用TUNEL法检测,按试剂盒提供的方法进行操作,细胞核中有棕黄色颗粒者即为阳性细胞,即凋亡细胞。
1.5 XIAP、Caspase3检测 采用SABC法(链霉亲和素生物素过氧化酶连接法) 免疫组化步骤按照试剂盒推荐方法进行(常规SABC法,DAB染色)。胞浆或核膜染色呈棕黄色为蛋白阳性表达。
1.6 结果处理 每张切片取5个视野, 在BI2000图像分析系统下用400 倍显微镜下分别测定每个视野XIAP、Caspase3、TUNEL阳性细胞个数，然后计算平均阳性细胞数。胞浆或核膜内染色呈棕黄色为XIAP蛋白阳性表达；胞浆或胞核内有棕黄色沉淀物为Caspase3蛋白阳性表达；细胞核中有棕黄色颗粒者即为TUNEL阳性细胞。
1.7 统计学处理 数据均以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS13.0统计软件分析，各组间比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 发作行为观察 正常对照组均未出现癫痫发作。模型组和rhGH组大鼠在给予匹罗卡品后10 min～30 min均出现竖毛，流涎，节律性点头，洗脸样动作等面部痉挛样动作，接着出现单侧或双侧前肢阵挛、站立，进一步发展为全身强直阵挛发作，双侧后肢强直，身体背屈，跌倒，反复发作，达到癫痫持续状态。
2.2 XIAP蛋白的表达 XIAP阳性细胞主要分布在海马CA1区和CA3区，其阳性细胞染色主要为胞浆、突起及核膜中呈棕黄色。对照组XIAP阳性细胞仅有微量的基础表达。与对照组相比，模型组6h时XIAP表达开始增强(P<0.05)，12h时XIAP的表达达到高峰(P<0.05)，24 h时XIAP的表达开始减弱(P<0.05),48h时XIAP的表达明显减弱(P<0.05)。rhGH组与模型组相比，SE后各个时间点(除6 h外)XIAP蛋白的表达均显著高于模型组(P<0.05)，表现为胞浆及核膜染色，呈棕黄色，胞浆内有棕黄色颗粒聚集。详见表1。
2.3 Caspase3蛋白的表达 Caspase3阳性细胞主要分布在海马CA1区和CA3区，其阳性细胞染色主要表现为胞浆或胞核内有棕黄色沉淀物。正常对照组可见大鼠海马内少量的弱染色的、散在的Caspase3阳性细胞。与对照组相比，模型组6 h时可见海马区内阳性细胞数开始增多；12 h时可见较多细胞的胞浆和核内出现棕黄色沉淀物；随时间点延长而表达增加，24 h时阳性细胞及染色深度达高峰；48 h时减少。rhGH组与模型组相比，6 h时阳性细胞数差异无统计学意义；12 h时可见较多阳性细胞，染色较深；Caspase3阳性细胞仍在24 h达高峰，但相应时间点Caspase3阳性细胞的表达较模型组轻微，各时间点Caspase3表达差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。
2.4 细胞凋亡检测 TUNEL阳性细胞要分布在海马CA1区和CA3区，其阳性细胞核染色呈棕黄色。对照组仅有少量的、散在的TUNEL阳性细胞表达，着色较浅。模型组6 h时TUNEL阳性细胞表达开始增多，并随时间点的延长阳性细胞表达增加，24 h达高峰，48 h减少。与模型组相比，rhGH组TUNEL阳性细胞数仍在24 h达高峰，但相应时间点TUNEL阳性细胞的表达均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。
3 讨 论 ......
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