短暂脑缺血对大鼠海马脑区锥体神经元外向整流氯通道功能的影响(2)
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1.3 脑缺血模型的制备 成年大鼠，分为CA1锥体神经元对照组及缺血再灌注后6 h和24 h实验组。采用血管夹闭方法进行短暂前脑缺血(15min)[7]。大鼠以水合氯醛麻醉(ip，40mg/100 g)，颈部切口，分离双侧颈总动脉。将大鼠固定于定位仪后，高温电凝双侧椎动脉，禁食过夜。以这种方法制备的大鼠没有明显的脑损害，行为正常。第2天，用动脉夹夹闭清醒的大鼠双侧颈总动脉15 min，以造成短暂前脑缺血模型。大鼠在60 s内昏迷，翻正反射消失，痛反射消失，双侧瞳孔放大。脑缺血15 min后解除动脉夹，恢复脑血流。具有这些症状的大鼠分别存活6 h或24 h后进行以下的细胞分离。部分脑片经甲醛溶液固定，克紫染色后光镜观察。缺血再灌注后出现惊厥等异常表现的大鼠予以排除，实验中保持37 ℃的大鼠体温。
1.4 统计学处理 全部数据以均数±标准差(x±s)表示，统计分析采用t检验和ANOVA方差分析。
2 结 果
2.1 急性分离大鼠海马神经元上外向整流氯离子通道的特性 实验采用全细胞膜片钳技术，钳制电压为-40 mV。给予斜坡电压程序(-80 mV～80 mV)后，可以在细胞上记录到一个双向电流。此电流具有外向整流特性，在-80 mV时的全细胞电流为(9.11±1.2)pA/pF,在80mV时的全细胞电流为(64.2±6.9) pA/pF。 翻转电位为-36.25 mV，接近于本试验中Cl-的平衡膜电位(-40 mV)。氯离子通道阻断剂DIDS能够阻断此通道电流活动。在浴槽液中加入1 mmol/L DIDS能够可逆性阻断外向整流氯离子通道。在+80 mV膜电位下，通道电流从(64.2±6.9)pA/pF下降到(11.43±13.76) pA/pF (P<0.01)。详见图1。
注：A为给予斜坡电压牵制程序记录到的原始电流图；B为电流电压关系曲线。
图1 大鼠海马锥体神经元上记录到的外向整流氯通道全细胞电流图
2.2 短暂脑缺血后大鼠海马CA1区锥体神经元外向整流氯通道的功能改变 短暂前脑缺血能够使海马CA1区锥体神经元广泛死亡，脑缺血7 d后，CA1区锥体神经元基本全部死亡，而CA3区和齿状回细胞基本正常。
短暂脑缺血后大鼠海马CA1区锥体神经元外向整流氯通道电流持续性增强。缺血后6 h和24 h的全细胞电流从正常的(9.11±1.2)pA/pF(-80 mV)和(64.2±6.9)pA/pF(80 mV)分别增强为：(15.80±1.70) pA/pF、(17.70±1.93) pA/pF(-80 mV)和(120.16±12.30)pA/pF、(129.82±11.83)pA/pF(+80 mV)(P<0.05)，与对照组相比明显增强。
注：A为给予斜坡电压牵制程序记录到的原始电流图；B为电流-电压关系曲线。
图2 短暂脑缺血后大鼠海马CA1区锥体神经元外向整流氯通道电流图
2.3 脑缺血前后海马CA3区锥体神经元外向整流氯通道特性的比较 证明外向整流氯通道活动增强是否为脑缺血后易损海马神经元的独特现象，或者仅仅为缺血后神经元的共同反应，这对于阐明外向整流氯通道在缺血性脑损伤中的作用十分重要。因此，我们进一步比较了脑缺血前后的CA3区锥体神经元外向整流氯通道的功能变化。采用同样全细胞电压钳记录技术，在CA3区锥体神经元记录到外向整流氯通道电流。
脑缺血前后的全细胞电流图，其电流值无明显差异。缺血前和缺血后24h的全细胞电流值分别为(11.4±1.47)pA/pF、(7.97±0.90)pA/pF(-80mV)和(60.14±7.13)pA/pF、(65.66±7.68) pA/pF(+80 mV)(P>0.05)，与对照组相比无明显变化。
注：A为给予斜坡电压牵制程序记录到的原始电流图；B为电流-电压关系曲线。
图3 短暂脑缺血后大鼠海马CA3区锥体神经元外向整流氯通道电流图
3 讨 论
本研究发现，脑缺血后大鼠海马CA1区锥体神经元外向整流氯通道的功能活动持续性增强，然而CA3区细胞氯通道电流无明显改变，这同以前报道的脑缺血再灌注后海马锥体神经元的细胞膜特性变化相符[8]。以往研究观察到脑缺血后大鼠海马锥体神经元同样出现选择性兴奋性改变，CA1神经元动作电位阈值增加而CA3细胞无变化。因为氯通道开放能够导致神经元超级化，所以脑缺血后氯通道活动增强导致的细胞超极化可能是CA1区神经元细胞膜兴奋性和自发放电频率降低的机制之一。
蛋白激酶能够调节外向整流氯通道的活动。酪氨酸激酶p125能够激活小肠上皮细胞膜上的外向整流氯离子通道，酪氨酸激酶p56也可以激活淋巴细胞膜上的外向整流氯通道，在胞浆侧加入酪氨酸激酶抑制剂可以抑制多种细胞上的外向整流氯通道电流[9,10]。酪氨酸激酶可被细胞肿胀和Fas受体信号激活。短暂脑缺血后，CA1锥体神经元中Fas受体蛋白及其配体大量表达。因此，推测脑缺血后外向整流氯通道活动增强可能是由于Fas信号通路激活了酪氨酸激酶所致[11]。这与酪氨酸激酶抑制剂能够保护脑缺血后CA1区锥体神经元死亡相符合[12]。
不同部位的神经元对缺血损伤的敏感度不同，15 min前脑缺血能够引起CA1区锥体神经元广泛死亡，然而基本不影响CA3和齿状回细胞。本实验发现CA1和CA3区神经元外向整流氯通道对脑缺血伤害性刺激的反应不同，CA1细胞上氯通道电流增强，而在CA3的细胞无显著变化。因此,认为脑缺血后CA1细胞外向整流氯通道活动持续性增强不但使神经元兴奋性进行性降低，而且参与了缺血性神经元损伤，大量研究[13，14]发现氯通道参与多种细胞的凋亡过程也支持我们提出的这一假说。
外向整流氯通道能够通过转运HCO-3-直接降低细胞内pH值，也能够通过易化Cl-/HCO-3-交换体分泌碳酸氢盐来间接降低细胞内pH值。细胞内酸化后激活酸性核酸内切酶，进而参与细胞凋亡的过程[15，16]。因此，脑缺血后海马CA1锥体神经元外向整流氯通道活动持续性增强可能通过降低细胞内pH值促进神经元凋亡。
外向整流氯通道引起的细胞容积改变是细胞凋亡的另一重要机制 ......
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