纤维蛋白胶对骨髓源性心肌干细胞增殖、迁移和缺血缺氧后的保护作用(3)
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参见附件。
将FGMCSC OGD组和MCSC OGD组的细胞缺血缺氧处理12 h后，加入AO/EB染色液，在荧光显微镜下观察细胞核的形态和着色。每孔随机选取5个视野，分别计数存活、凋亡、坏死细胞。实验重复3次，计算存活、凋亡和坏死细胞所占细胞总数的比例。
1.2.7 LDH的检测 细胞凋亡或坏死可以造成细胞膜结构的损害或完全裂解，从而导致细胞内的LDH释放外泄进入培养液。LDH泄漏法的测定是基于在乳酸脱氢酶的作用下使四唑盐染料碘硝基氯化四氮唑还原为红色甲臜，通过比色法定量测定酶含量，以评价细胞损伤程度。将FGMCSC OGD组和MCSC OGD组细胞缺血缺氧处理12 h后，取出培养板，分别从培养板各孔吸取上清100 μL，加到反应板孔中，37 ℃放置10 min。配制乳酸脱氢酶底物溶液：氧化型辅酶I 10 mg，PMS 2 mg，NBT 5 mg，用蒸馏水2 mL溶解，混匀，静置5 min。取上部溶液 1.5 mL，加入0.4 mL 1 mol/L乳酸钠溶液。用0.1 mol/L pH7.4的磷酸缓冲液定容到10 mL。每孔加入新鲜配制的底物溶液 100 μL，室温避光反应15 min，然后每孔加入25 μL柠檬酸液终止酶促反应。在酶标仪570 nm波长下读取各孔OD值，计算各个样本的平均值。
1.3 统计学处理 采用SPSS 15统计软件处理数据，数据用均数±标准差(x±s)表示，各组间的差别采用单因素方差分析进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 不同浓度FG对MCSC黏附和存活的影响(见表1) 高浓度FG几乎不透明，有一定的弹性和机械强度，经牵拉不易变形。而低浓度FG为一种透明的凝胶，弹性较高，但机械强度较差，机械牵拉极易导致凝胶变形。将MCSC接种到高浓度FG内，细胞伸展受限。MCSC在低浓度FG内培养2 h，相差显微镜下可见MCSC在FG内均匀散在分布，少数细胞已开始伸展。培养24 h后，大部分MCSC铺展，呈现成纤维细胞样形态。在FG中培养7 d后，高浓度FG组MCSC的数目较少，细胞增殖不明显，且细胞伸展欠佳；在低浓度FG组，培养7 d后MCSC的数量明显增多，细胞呈成纤维细胞样，伸展良好，未出现明显的凋亡或坏死。
2.2 MCSC在FG中的增殖(见表2) 接种后2 h，MCSC在FG内均匀散在分布，少数细胞已开始伸展。接种后1 d～7 d，FG组大部分MCSC细胞保持正常的形态，具有较好的活力。而在单独MCSC组，接种后5 d～7 d，可见上清液中出现部分漂浮细胞。通过比较DiI标记的细胞数目发现，MCSC在FG内能够保持较好的增殖能力，在接种后5 d和7 d，与MCSC组相比，细胞数目显著增加。
2.3 MCSC在FG中的迁移(见表3) 损伤实验结果发现，接种后1 d和2 d，仅有少量细胞从FG的刮除线边缘迁出。在接种后3 d，有大量细胞从FG中迁出。在迁移实验中，接种后1 d，有许多细胞从FG自然形成的边缘迁出。接种后2 d和3 d，有更多的细胞自FG的自然边缘迁移到FG外。
2.4 FG对MCSC的保护作用(见表4) 正常培养的MCSC很少发生凋亡或坏死，而经缺氧缺糖处理12 h后，在MCSC OGD组，大部分MCSC细胞核表现出明显的凋亡或坏死形态变化。与MCSC OGD组相比，FGMCSC OGD组MCSC的存活数目较高，凋亡和坏死细胞数目较低。MCSC经缺氧缺糖处理后可释放大量LDH，上清液中LDH的水平显著升高，虽然FGMCSC OGD组LDH的水平仍高于MCSC组，但明显低于MCSC OGD组。
3 讨 论
生物材料是一类具有特殊功能的，用于机体组织修复和再生的材料[11]。生物材料能够促进细胞黏附、存活和分化，对优化干细胞移植微环境和提高干细胞移植治疗心肌梗死的效果具有重要的临床指导意义。在多种生物材料中，FG具有较大的优势，它可以从病人自身血液制备，能够避免免疫反应，并且可重复性好，已广泛用于外科领域的止血和创伤修复[3]。本研究发现，在接种后7 d内，MCSC在FG中能够保持较高的活力。通过比较DiI标记的细胞数目，发现MCSC在FG内能够很好地增殖。以上结果表明，FG具有很好的生物相容性，FG可以为MCSC提供一个良好的生长微环境，并且5 mg/mL纤维蛋白原形成的低浓度FG比高浓度的FG更适合细胞的生长与增殖。
我们首次通过体外建立缺血缺氧模型，研究FG对MCSC抗缺血缺氧的保护作用。经缺血缺氧处理12 h后，MCSC OGD组大部分MCSC细胞核表现出明显的凋亡或坏死形态变化。而FGMCSC OGD组大部分细胞仍保持较好的形态，凋亡或坏死的细胞数目明显较少。LDH泄漏法可以定量反映细胞膜的损伤程度。缺血缺氧处理可以导致MCSC中LDH的大量释放。在MCSC组，上清液中LDH的水平显著升高，而FGMCSC OGD组LDH的水平比MCSC OGD组明显较低。以上结果提示，缺血缺氧可以导致MCSC发生明显的凋亡和坏死，而FG有助于细胞抵抗缺血缺氧微环境，提高其存活能力。FG提供的三维微环境可以直接促进MCSC的存活。FG也可通某些特异性配体，与MCSC表面受体结合，进而激活下游信号传导通路，发挥保护细胞抵抗缺血缺氧的作用。另外，FG也可能通过影响MCSC的旁分泌间接促进MCSC的存活。最近的研究表明，生物材料可以与干细胞发生相互作用，提高干细胞胰岛素样生长因子1和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)等细胞因子的释放[12]。由于生物材料的缓释的作用，这些细胞因子能较长时间的停留在生物材料中，对于细胞的存活可能发挥间接的调控作用[13] ......
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