甘露醇对小鼠脑缺血再灌注后环氧化酶—2表达的影响(1)
摘要：目的 探讨不同时间甘露醇处理对小鼠前脑缺血再灌注损伤细胞内环氧化酶2(COX2)表达的影响。方法 采用双侧颈总动脉结扎脑缺血再灌注损伤模型，随机分为6组，假手术组、缺血再灌注损伤组和甘露醇即刻、30 min、1 h、1.5 h干预组。分别用HE 和COX2免疫组化染色，观察再灌注损伤后不同时间点甘露醇干预后海马CA1区神经元病理组织形态学特点，运用BI2000医学图像分析系统检测COX2表达平均光密度值。结果 甘露醇即刻干预组小鼠海马CA1区COX2表达平均光密度值明显低于缺血再灌注对照组(P<0.05)，而与假手术组比较无统计学意义(P>0.05)；30 min后甘露醇干预组COX2蛋白表达增多、光密度值增高，与缺血再灌注损伤组比较均无统计学意义(P>0.05)。结论 早期应用甘露醇能够有效防止COX2表达，避免了脑缺血再灌注损伤后COX2介导的神经细胞不逆性损伤。再灌注30 min以后甘露醇干预基本无效。
关键词：甘露醇；脑缺血再灌注损伤；海马CA1区；环氧化酶2
, 百拇医药
中图分类号：R743 R255.2 文献标识码：A 文章编号：16721349(2012)10
20%甘露醇注射液作为治疗脑水肿、降低颅内压的常用药在临床广泛应用，特别是在急救心肺脑复苏过程中的治疗中尤其重要。目前，关于甘露醇在心肺脑复苏中最佳给药时间上没有给予应有的关注，本课题利用郗东峰等[1]报道的小鼠脑缺血再灌注损伤模型，于再灌注后不同时间点采用甘露醇干预，观察其对小鼠脑海马CA1区细胞内环氧化酶2(COX2)表达情况的影响，从而为临床救治过程中心肺脑复苏提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康昆明小鼠36只，体重(35±5)g，雌雄随机，清洁级。本次实验随机分为6组，每组6只。假手术组分离双侧颈总动脉，穿线，但不结扎；缺血再灌注损伤组分离双侧颈总动脉，穿线结扎1 h后再灌注，但不给药；甘露醇即刻干预组、甘露醇30 min干预组、甘露醇1 h干预组、甘露醇1.5 h干预组分离双侧颈总动脉，结扎 1 h后再灌注，分别在再灌注即刻、30 min、1 h和1.5 h尾静脉注射20%甘露醇1 g/kg。
, 百拇医药
1.2 主要药品及试剂 20%甘露醇注射液(石家庄四药有限公司，批准文号：国药准字H13023007，批号：090217404)，兔多抗COX2多克隆抗体、生物素标记的山羊抗兔IgG、SABC、DAB显色试剂盒、5%BSA封闭液(武汉博士德公司)。
1.3 模型制备 采用郗东风等[1]报道的昆明小鼠双侧颈总动脉结扎脑缺血再灌注损伤模型，造模成功后分别用HE和COX2免疫组化染色。
1.4 计算机图像分析 用数码成像仪在显微镜下采集图片，拍摄图像，所得图像采用BI2000医学图像分析系统进行图像半定量分析，在400倍光学显微镜下，取病灶周围5个不重复高倍镜视野，测定细胞中棕黄色和棕褐色阳性表达颗粒的平均光密度(OD)值，取其平均值作为结果，越高表示蛋白表达越强。
1.5 统计学处理 数据以均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析，组间进行多重比较，SPSS17.0统计软件包分析。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 细胞组织形态学表现 假手术组：海马CA1区锥体细胞有层次分明的4～5层细胞结构，胞质均质红染，核大而圆，细胞层向心侧间质呈纤维束样结构，排列整齐。缺血再灌注损伤组：正常锥体细胞数明显减少，可见大量的变性坏死细胞形成的坏死灶，胞浆内有空泡形成。细胞层排列散乱。细胞间质变性，神经索模糊不清。甘露醇即刻干预组：绝大多数椎体细胞保持正常形态，4层～5层细胞结构完好。纤维结构清晰可辨。细胞间可见少数的固缩、深染的细胞核，比较A组细胞肿胀，胞质疏松。甘露醇30 min、1 h、1.5 h干预组：细胞层排列散乱。虽然较缺血再灌注损伤组间质水肿有所改善，但纤维样结构凌乱不清晰，并有断续现象。变性和坏死细胞数较多。
2.2 COX2在脑组织的表达 假手术组几乎不见海马CA1区锥体细胞表达COX2的阳性细胞；缺血再灌注损伤组可见大量棕黄色阳性细胞；甘露醇干预组部分血管内皮细胞及海马区部分神经元表达COX2的阳性；甘露醇30 min、1 h、1.5 h干预组海马CA1区神经元阳性细胞显著增多，着色加深。
, 百拇医药
2.3 平均光密度(OD)值 甘露醇即刻干预组海马CA1区平均光密度值低于缺血再灌注组(P<0.05)；与假手术组比较无统计学意义(P>0.05)；甘露醇30 min、1 h、1.5 h干预组与缺血再灌注组比较无统计学意义(P>0.05)。详见表1。
3 讨 论
医学急救中脑复苏环节是保证远期复苏效果的关键。近年来脑保护方法的研究分为缺血前处理[2]和缺血后处理[3]，现阶段多数对脑缺血再灌注损伤干预措施的研究集中于缺血再灌注损伤发生前的预处理，由于临床意外难以预见，预处理的方法常常无助于临床意外脑损伤的救治，因此，近年来相关研究越来越关注缺血再灌注损伤后的医学救治。鉴于脑缺血再灌注后坏死、凋亡、过氧化物、钙超载等细胞病理机制的不可逆性，医学研究应该关注细胞的可逆性病理损害，以组织细胞水肿变性病变作为观察对象更具有现实意义。
2008年郗东锋等[1]报道了昆明小鼠前脑缺血再灌注损害实验动物模型制备方法，该实验动物模型与其他同类研究的动物模型相比成本低廉，简单易行，成功率高，重复性好，且损伤程度适中，可以通过组织水肿变性病变作为观察指标，获得脑缺血再灌注损伤救治的相关研究结果。2009年王雪红等[4]和邢春平等[5]分别采用该动物模型评价了纳洛酮和地塞米松的救治效果。2010年郭文义等[6]采用该动物模型发现，再灌注即刻甘露醇干预具有显著的脑保护作用，但再灌注30 min以后给予甘露醇基本无效。
环氧合酶(COX)是催化花生四烯酸合成前列腺素和血栓素的限速酶，能引起炎症反应并介导炎症细胞毒性。在正常情况下，哺乳动物脑内不表达COX2，在缺血和缺氧引起的炎症反应中，COX2表达增高，主要在神经元和血管内皮细胞表达[7]。COX2在神经组织中的表达可直接损伤神经元，并引起细胞损伤和脑水肿[8]。, 百拇医药(董宝花 赵嘉训)
关键词：甘露醇；脑缺血再灌注损伤；海马CA1区；环氧化酶2
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中图分类号：R743 R255.2 文献标识码：A 文章编号：16721349(2012)10
20%甘露醇注射液作为治疗脑水肿、降低颅内压的常用药在临床广泛应用，特别是在急救心肺脑复苏过程中的治疗中尤其重要。目前，关于甘露醇在心肺脑复苏中最佳给药时间上没有给予应有的关注，本课题利用郗东峰等[1]报道的小鼠脑缺血再灌注损伤模型，于再灌注后不同时间点采用甘露醇干预，观察其对小鼠脑海马CA1区细胞内环氧化酶2(COX2)表达情况的影响，从而为临床救治过程中心肺脑复苏提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康昆明小鼠36只，体重(35±5)g，雌雄随机，清洁级。本次实验随机分为6组，每组6只。假手术组分离双侧颈总动脉，穿线，但不结扎；缺血再灌注损伤组分离双侧颈总动脉，穿线结扎1 h后再灌注，但不给药；甘露醇即刻干预组、甘露醇30 min干预组、甘露醇1 h干预组、甘露醇1.5 h干预组分离双侧颈总动脉，结扎 1 h后再灌注，分别在再灌注即刻、30 min、1 h和1.5 h尾静脉注射20%甘露醇1 g/kg。
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1.2 主要药品及试剂 20%甘露醇注射液(石家庄四药有限公司，批准文号：国药准字H13023007，批号：090217404)，兔多抗COX2多克隆抗体、生物素标记的山羊抗兔IgG、SABC、DAB显色试剂盒、5%BSA封闭液(武汉博士德公司)。
1.3 模型制备 采用郗东风等[1]报道的昆明小鼠双侧颈总动脉结扎脑缺血再灌注损伤模型，造模成功后分别用HE和COX2免疫组化染色。
1.4 计算机图像分析 用数码成像仪在显微镜下采集图片，拍摄图像，所得图像采用BI2000医学图像分析系统进行图像半定量分析，在400倍光学显微镜下，取病灶周围5个不重复高倍镜视野，测定细胞中棕黄色和棕褐色阳性表达颗粒的平均光密度(OD)值，取其平均值作为结果，越高表示蛋白表达越强。
1.5 统计学处理 数据以均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析，组间进行多重比较，SPSS17.0统计软件包分析。
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2 结 果
2.1 细胞组织形态学表现 假手术组：海马CA1区锥体细胞有层次分明的4～5层细胞结构，胞质均质红染，核大而圆，细胞层向心侧间质呈纤维束样结构，排列整齐。缺血再灌注损伤组：正常锥体细胞数明显减少，可见大量的变性坏死细胞形成的坏死灶，胞浆内有空泡形成。细胞层排列散乱。细胞间质变性，神经索模糊不清。甘露醇即刻干预组：绝大多数椎体细胞保持正常形态，4层～5层细胞结构完好。纤维结构清晰可辨。细胞间可见少数的固缩、深染的细胞核，比较A组细胞肿胀，胞质疏松。甘露醇30 min、1 h、1.5 h干预组：细胞层排列散乱。虽然较缺血再灌注损伤组间质水肿有所改善，但纤维样结构凌乱不清晰，并有断续现象。变性和坏死细胞数较多。
2.2 COX2在脑组织的表达 假手术组几乎不见海马CA1区锥体细胞表达COX2的阳性细胞；缺血再灌注损伤组可见大量棕黄色阳性细胞；甘露醇干预组部分血管内皮细胞及海马区部分神经元表达COX2的阳性；甘露醇30 min、1 h、1.5 h干预组海马CA1区神经元阳性细胞显著增多，着色加深。
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2.3 平均光密度(OD)值 甘露醇即刻干预组海马CA1区平均光密度值低于缺血再灌注组(P<0.05)；与假手术组比较无统计学意义(P>0.05)；甘露醇30 min、1 h、1.5 h干预组与缺血再灌注组比较无统计学意义(P>0.05)。详见表1。
3 讨 论
医学急救中脑复苏环节是保证远期复苏效果的关键。近年来脑保护方法的研究分为缺血前处理[2]和缺血后处理[3]，现阶段多数对脑缺血再灌注损伤干预措施的研究集中于缺血再灌注损伤发生前的预处理，由于临床意外难以预见，预处理的方法常常无助于临床意外脑损伤的救治，因此，近年来相关研究越来越关注缺血再灌注损伤后的医学救治。鉴于脑缺血再灌注后坏死、凋亡、过氧化物、钙超载等细胞病理机制的不可逆性，医学研究应该关注细胞的可逆性病理损害，以组织细胞水肿变性病变作为观察对象更具有现实意义。
2008年郗东锋等[1]报道了昆明小鼠前脑缺血再灌注损害实验动物模型制备方法，该实验动物模型与其他同类研究的动物模型相比成本低廉，简单易行，成功率高，重复性好，且损伤程度适中，可以通过组织水肿变性病变作为观察指标，获得脑缺血再灌注损伤救治的相关研究结果。2009年王雪红等[4]和邢春平等[5]分别采用该动物模型评价了纳洛酮和地塞米松的救治效果。2010年郭文义等[6]采用该动物模型发现，再灌注即刻甘露醇干预具有显著的脑保护作用，但再灌注30 min以后给予甘露醇基本无效。
环氧合酶(COX)是催化花生四烯酸合成前列腺素和血栓素的限速酶，能引起炎症反应并介导炎症细胞毒性。在正常情况下，哺乳动物脑内不表达COX2，在缺血和缺氧引起的炎症反应中，COX2表达增高，主要在神经元和血管内皮细胞表达[7]。COX2在神经组织中的表达可直接损伤神经元，并引起细胞损伤和脑水肿[8]。, 百拇医药(董宝花 赵嘉训)