原代大鼠胰岛的分离纯化及功能鉴定(1)
摘要：目的探讨成年大鼠胰岛分离、纯化的方法，为成人胰岛的分离纯化奠定基础。方法通过用胶原酶P消化胰腺及利用Histopaque 1077分离液离心分离纯化雄性SD大鼠胰岛，用双硫棕(DTZ)染色，吖啶橙碘化丙啶(AO/PI)染色和胰岛素分泌实验来鉴定胰岛的纯度、活性和功能；利用激光共聚焦技术检测胰岛细胞中钙离子浓度。结果分离获得的胰岛可被DTZ和AO/PI分别染成猩红色和绿色；体外刺激胰岛素分泌实验，2.8 mM、8.3 mM、16.7mM葡萄糖情况下胰岛素分泌量分别是：(11.7 ± 1.4)uIU/mL、(38.2 ± 8.7)uIU/mL、(86.3 ± 5.1)uIU/mL；在2.8 mM葡萄糖基础上，8.3 mM葡萄糖明显增加胰岛细胞中钙离子浓度，16.7 mM葡萄糖在8.3 mM葡萄糖基础上又进一步升高钙离子浓度。结论采用胶原酶P消化法及Histopaque 1077分离液离心分得的胰岛纯度高，活性、功能良好，随着葡萄糖浓度的增加，胰岛细胞中钙离子浓度明显增加。
关键词：胰岛；分离；钙离子；原代大鼠
, http://www.100md.com
中图分类号：R329.2R256.2文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.16721349.2014.03.051文章编号：16721349(2014)03034502
老年人是糖尿病高发人群，在全部心脑血管病死亡的病例中，除直接与糖尿病有关外，其余13%的病例与高血糖有关，高血压合并糖尿病成为脑卒中死亡的重要原因[1]。近年来有关糖尿病治疗研究引起了人们的关注，其中有很多胰岛移植的研究。随着分子生物学技术的发展，虽然各个方面取得了很大进步，但其移植效果并不理想，在人体的胰岛移植中，活性能保持一年以上不超过40%[2]。其主要原因是胰岛分离纯化后活性不高，移植后的排斥反应以及免疫抑制剂对大鼠胰岛的毒性作用[3]。因此获得足量、活性良好的胰岛非常重要。本实验采用胶原酶P消化胰腺及Histopaque 1077分离液直接离心分得大鼠胰岛，并对其活性及功能进行评价。
1材料与方法
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1.1动物雄性SD大鼠，体重250 g～300 g，由山西医科大学实验动物中心提供。
1.2试剂胶原酶P购自瑞士罗氏公司；双硫棕(DTZ)、HEPES、葡萄糖、多聚赖氨酸(分子量15～30万)购自美国Sigma公司；1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；DispaseⅡ购自美国Amresco公司；青链霉素(双抗)购自北京索莱宝公司；AOPI购自南京建成生物科技有限公司；大鼠胰岛素放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所。
1.3主要仪器超净工作台(北京世安科技林净化技术有限公司)；CO2细胞培养箱(北京博奥恒信生物科技有限公司)；台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；奥林巴斯激光共聚焦显微镜IX81(日本奥林巴斯IX51)。
1.4方法
1.4.1原代大鼠胰岛及胰岛细胞分离培养无菌条件下，大鼠断头处死，迅速打开胸腹，在胆总管汇入十二指肠的入口处用止血钳夹住，经胆总管缓慢注入13 mL 4 ℃的1 mg/mL胶原酶P溶液，38 ℃水浴消化11 min，取出立即加入20 mL 4℃培养液(含10%胎牛血清)终止消化，剧烈振摇胰腺至细沙状，用孔径350 μm的滤网过滤，1 200 r/min，离心2 min，去上清，加入10 mL分离液Histopaque 1077至管中重悬组织，将10 mL 1640培养基慢慢顺管壁注入管中，3 200 r/min，离心23 min。收集界面间的悬浮胰岛，在含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素的1 640培养基中培养，并置于37℃，5% CO2，100%湿度的孵箱中培养[4]。将胰岛用含3 mmol/L EDTA的无钙镁PBS溶液脱钙后，加入DispaseⅡ(5 mg/mL)酶液，培养箱孵育6 min，用4℃培养液终止消化，吹打使胰岛分散，1 000 r/min，离心2 min，将胰岛细胞接种在培养皿中，按胰岛培养条件培养[4]。
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1.4.2大鼠胰岛的DTZ纯度鉴定DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO，用Hanks液(pH7.8) 1∶1 000稀释，0.22 μm孔径滤膜过滤，与胰岛制备物混合，室温10 min后镜检[5]；大鼠胰岛的AO/PI活性鉴定：用Hanks液配制储存液，AO：670 μmol/L，PI：750 μmol/L，4 ℃避光保存，使用前取0.01 mL AO与1 mL PI 混合，用Hanks液10倍稀释，0.22 μm孔径滤膜过滤，与胰岛混合10 min，在荧光显微镜下采用490 nm激发光，510 nm发射光镜检[6]。
1.4.3胰岛素分泌实验配置葡萄糖浓度分别是2.8 mM，8.3 mM，16.7 mM的KRBH孵育液。方法：①取6个Eppendorf管标号，各加1 mL 2.8 mM葡萄糖的KRBH液，每管挑入5个胰岛，37℃孵育30 min后，弃上清。②每管再加入1 mL 2.8 mM葡萄糖的KRBH液孵育，37℃孵育30 min，收集上清，标号，-20℃保存待测。③依次给予8.3 mM葡萄糖、16.7mM葡萄糖孵育，方法同上，收集上清，-20℃保存待测。用放射免疫法检测上述待测样品。
1.4.4激光共聚焦检测细胞内部钙离子浓度胰岛用Fluo 4AM(4 μM)染料在37℃的条件下孵育半小时，孵育完用含2.8 mM糖的Hanks液轻轻冲洗两遍，防止染液残留影响之后的细胞内钙离子浓度的测定，再加入2 mL 含2.8 mM糖Hanks液。使用奥林巴斯激光共聚焦显微镜IX81观察，设置激光波长494 nm，发射波长516 nm。所得到的比值F/F0(细胞荧光减去背景荧光和自身荧光)反应细胞内钙离子浓度的变化[4]。, http://www.100md.com
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李小东 郭庆 高璟英 张婉 武冬梅 刘云峰 章毅 山西医科大学;山西医科大学基础医学院药理教研室;山西医科大学第一医院;
【摘要】目的探讨成年大鼠胰岛分离、纯化的方法,为成人胰岛的分离纯化奠定基础。方法通过用胶原酶P消化胰腺及利用Histopaque 1077分离液离心分离纯化雄性SD大鼠胰岛,用双硫棕(DTZ)染色,吖啶橙-碘化丙啶(AO/PI)染色和胰岛素分泌实验来鉴定胰岛的纯度、活性和功能;利用激光共聚焦技术检测胰岛细胞中钙离子浓度。结果分离获得的胰岛可被DTZ和AO/PI分别染成猩红色和绿色;体外刺激胰岛素分泌实验,2.8mM、8.3mM、16.7mM葡萄糖情况下胰岛素分泌量分别是:(11.7±1.4)uIU/mL、(38.2±8.7)uIU/mL、(86.3±5.1)uIU/mL;在2.8mM葡萄糖基础上,8.3mM葡萄糖明显增加胰岛细胞中钙离子浓度,16.7mM葡萄糖在8.3mM葡萄糖基础上又进一步升高钙离子浓度。结论采用胶原酶P消化法及Histopaque 1077分离液离心分得的胰岛纯度高,活性、功能良好,随着葡萄糖浓度的增加,胰岛细胞中钙离子浓度明显增加。
【关键词】 胰岛 分离 钙离子 原代大鼠
【基金】国家自然科学基金(No.NSFC 81070662,81273564) 山西省自然科学基金(No.2012011039-8) 山西省高等学校优秀青年学术带头人支持计划(No.2011-24) 山西省留学人员科技活动项目择优资助(No.2011-762) 山西省回国留学人员科研资助项目(No.2012-046) 山西省卫生厅科研课题(No.201201062)
【分类号】R587.1
老年人是糖尿病高发人群,在全部心脑血管病死亡的病例中,除直接与糖尿病有关外,其余13%的病例与高血糖有关,高血压合并糖尿病成为脑卒中死亡的重要原因[1]。近年来有关糖尿病治疗研究引起了人们的关注,其中有很多胰岛移植的研究。随着分子生物学技术的发展,虽然各个方面取得(李小东 郭庆 高璟英 张婉 武冬梅 刘云峰 章毅)
关键词：胰岛；分离；钙离子；原代大鼠
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中图分类号：R329.2R256.2文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.16721349.2014.03.051文章编号：16721349(2014)03034502
老年人是糖尿病高发人群，在全部心脑血管病死亡的病例中，除直接与糖尿病有关外，其余13%的病例与高血糖有关，高血压合并糖尿病成为脑卒中死亡的重要原因[1]。近年来有关糖尿病治疗研究引起了人们的关注，其中有很多胰岛移植的研究。随着分子生物学技术的发展，虽然各个方面取得了很大进步，但其移植效果并不理想，在人体的胰岛移植中，活性能保持一年以上不超过40%[2]。其主要原因是胰岛分离纯化后活性不高，移植后的排斥反应以及免疫抑制剂对大鼠胰岛的毒性作用[3]。因此获得足量、活性良好的胰岛非常重要。本实验采用胶原酶P消化胰腺及Histopaque 1077分离液直接离心分得大鼠胰岛，并对其活性及功能进行评价。
1材料与方法
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1.1动物雄性SD大鼠，体重250 g～300 g，由山西医科大学实验动物中心提供。
1.2试剂胶原酶P购自瑞士罗氏公司；双硫棕(DTZ)、HEPES、葡萄糖、多聚赖氨酸(分子量15～30万)购自美国Sigma公司；1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；DispaseⅡ购自美国Amresco公司；青链霉素(双抗)购自北京索莱宝公司；AOPI购自南京建成生物科技有限公司；大鼠胰岛素放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所。
1.3主要仪器超净工作台(北京世安科技林净化技术有限公司)；CO2细胞培养箱(北京博奥恒信生物科技有限公司)；台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；奥林巴斯激光共聚焦显微镜IX81(日本奥林巴斯IX51)。
1.4方法
1.4.1原代大鼠胰岛及胰岛细胞分离培养无菌条件下，大鼠断头处死，迅速打开胸腹，在胆总管汇入十二指肠的入口处用止血钳夹住，经胆总管缓慢注入13 mL 4 ℃的1 mg/mL胶原酶P溶液，38 ℃水浴消化11 min，取出立即加入20 mL 4℃培养液(含10%胎牛血清)终止消化，剧烈振摇胰腺至细沙状，用孔径350 μm的滤网过滤，1 200 r/min，离心2 min，去上清，加入10 mL分离液Histopaque 1077至管中重悬组织，将10 mL 1640培养基慢慢顺管壁注入管中，3 200 r/min，离心23 min。收集界面间的悬浮胰岛，在含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素的1 640培养基中培养，并置于37℃，5% CO2，100%湿度的孵箱中培养[4]。将胰岛用含3 mmol/L EDTA的无钙镁PBS溶液脱钙后，加入DispaseⅡ(5 mg/mL)酶液，培养箱孵育6 min，用4℃培养液终止消化，吹打使胰岛分散，1 000 r/min，离心2 min，将胰岛细胞接种在培养皿中，按胰岛培养条件培养[4]。
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1.4.2大鼠胰岛的DTZ纯度鉴定DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO，用Hanks液(pH7.8) 1∶1 000稀释，0.22 μm孔径滤膜过滤，与胰岛制备物混合，室温10 min后镜检[5]；大鼠胰岛的AO/PI活性鉴定：用Hanks液配制储存液，AO：670 μmol/L，PI：750 μmol/L，4 ℃避光保存，使用前取0.01 mL AO与1 mL PI 混合，用Hanks液10倍稀释，0.22 μm孔径滤膜过滤，与胰岛混合10 min，在荧光显微镜下采用490 nm激发光，510 nm发射光镜检[6]。
1.4.3胰岛素分泌实验配置葡萄糖浓度分别是2.8 mM，8.3 mM，16.7 mM的KRBH孵育液。方法：①取6个Eppendorf管标号，各加1 mL 2.8 mM葡萄糖的KRBH液，每管挑入5个胰岛，37℃孵育30 min后，弃上清。②每管再加入1 mL 2.8 mM葡萄糖的KRBH液孵育，37℃孵育30 min，收集上清，标号，-20℃保存待测。③依次给予8.3 mM葡萄糖、16.7mM葡萄糖孵育，方法同上，收集上清，-20℃保存待测。用放射免疫法检测上述待测样品。
1.4.4激光共聚焦检测细胞内部钙离子浓度胰岛用Fluo 4AM(4 μM)染料在37℃的条件下孵育半小时，孵育完用含2.8 mM糖的Hanks液轻轻冲洗两遍，防止染液残留影响之后的细胞内钙离子浓度的测定，再加入2 mL 含2.8 mM糖Hanks液。使用奥林巴斯激光共聚焦显微镜IX81观察，设置激光波长494 nm，发射波长516 nm。所得到的比值F/F0(细胞荧光减去背景荧光和自身荧光)反应细胞内钙离子浓度的变化[4]。, http://www.100md.com
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李小东 郭庆 高璟英 张婉 武冬梅 刘云峰 章毅 山西医科大学;山西医科大学基础医学院药理教研室;山西医科大学第一医院;
【摘要】目的探讨成年大鼠胰岛分离、纯化的方法,为成人胰岛的分离纯化奠定基础。方法通过用胶原酶P消化胰腺及利用Histopaque 1077分离液离心分离纯化雄性SD大鼠胰岛,用双硫棕(DTZ)染色,吖啶橙-碘化丙啶(AO/PI)染色和胰岛素分泌实验来鉴定胰岛的纯度、活性和功能;利用激光共聚焦技术检测胰岛细胞中钙离子浓度。结果分离获得的胰岛可被DTZ和AO/PI分别染成猩红色和绿色;体外刺激胰岛素分泌实验,2.8mM、8.3mM、16.7mM葡萄糖情况下胰岛素分泌量分别是:(11.7±1.4)uIU/mL、(38.2±8.7)uIU/mL、(86.3±5.1)uIU/mL;在2.8mM葡萄糖基础上,8.3mM葡萄糖明显增加胰岛细胞中钙离子浓度,16.7mM葡萄糖在8.3mM葡萄糖基础上又进一步升高钙离子浓度。结论采用胶原酶P消化法及Histopaque 1077分离液离心分得的胰岛纯度高,活性、功能良好,随着葡萄糖浓度的增加,胰岛细胞中钙离子浓度明显增加。
【关键词】 胰岛 分离 钙离子 原代大鼠
【基金】国家自然科学基金(No.NSFC 81070662,81273564) 山西省自然科学基金(No.2012011039-8) 山西省高等学校优秀青年学术带头人支持计划(No.2011-24) 山西省留学人员科技活动项目择优资助(No.2011-762) 山西省回国留学人员科研资助项目(No.2012-046) 山西省卫生厅科研课题(No.201201062)
【分类号】R587.1
老年人是糖尿病高发人群,在全部心脑血管病死亡的病例中,除直接与糖尿病有关外,其余13%的病例与高血糖有关,高血压合并糖尿病成为脑卒中死亡的重要原因[1]。近年来有关糖尿病治疗研究引起了人们的关注,其中有很多胰岛移植的研究。随着分子生物学技术的发展,虽然各个方面取得(李小东 郭庆 高璟英 张婉 武冬梅 刘云峰 章毅)