激肽释放酶对氧糖剥夺皮层神经元线粒体运动调节蛋白的影响(2)
参见附件。
1.6 神经元活力检测 按活细胞计数试剂盒说明书操作检测神经元存活率。将培养至7 d的96孔板内皮层神经元按上述1.5方法进行干预。干预结束时，弃去上述各组神经元培养液，用正常细胞液洗涤3次，每孔加入神经元活力检测液100 μL(含10% CCK-8液和90% NeurobasalA液)，37 ℃培养箱孵育1 h～3 h。以仅有检测液的孔为空白对照，在450 nm为测定波长，630 nm为参比波长条件下，测定各样品的吸光度(OD值)。每组取4个复孔，分别进行3次独立实验。按公式：神经元存活率(%) =实验组OD值/对照组OD值×100%计算神经元存活率。
1.7 Caspase-3活性检测 将接种于直径10 cm培养皿内的皮层神经元培养至第7 天，各组神经元处理方法同上述1.5。干预结束后，收集各组细胞，加入RIPA蛋白质提取液，4 ℃静置1 h(期间吹打数次使细胞充分裂解)后，4 ℃18 000 g离心20 min，取上清液，按BCA法蛋白浓度测定试剂盒说明书测定上清液的蛋白浓度。Caspase-3活性测定：按Caspase-3 活性检测试剂盒(R&D公司)说明书操作。简言之，按100 μg蛋白的量提取的蛋白上清液，与等体积反应缓冲液混合后用试剂盒内的蛋白稀释液将各组混合液体积调节至200 μL，分别加入96孔板内，每孔再加5 μL Caspase-3荧光底物，混匀后置37 ℃孵育2 h。以双蒸水替代蛋白上清液、反应缓冲液及底物组成的等体积混合液为对照1(C1)，以不含反应底物的混合液为对照2(C2)，以505 nm为测定波长，650 nm为参比波长，测定各孔的吸光度(OD值) 。每次实验取3 个复孔，分别进行3 次独立实验。按公式：Caspase-3相对活性=实验组OD值-(C1+C2)OD值/对照组OD 值-(C1+C2)OD值计算各组Caspase-3的相对活性 ......
1.6 神经元活力检测 按活细胞计数试剂盒说明书操作检测神经元存活率。将培养至7 d的96孔板内皮层神经元按上述1.5方法进行干预。干预结束时，弃去上述各组神经元培养液，用正常细胞液洗涤3次，每孔加入神经元活力检测液100 μL(含10% CCK-8液和90% NeurobasalA液)，37 ℃培养箱孵育1 h～3 h。以仅有检测液的孔为空白对照，在450 nm为测定波长，630 nm为参比波长条件下，测定各样品的吸光度(OD值)。每组取4个复孔，分别进行3次独立实验。按公式：神经元存活率(%) =实验组OD值/对照组OD值×100%计算神经元存活率。
1.7 Caspase-3活性检测 将接种于直径10 cm培养皿内的皮层神经元培养至第7 天，各组神经元处理方法同上述1.5。干预结束后，收集各组细胞，加入RIPA蛋白质提取液，4 ℃静置1 h(期间吹打数次使细胞充分裂解)后，4 ℃18 000 g离心20 min，取上清液，按BCA法蛋白浓度测定试剂盒说明书测定上清液的蛋白浓度。Caspase-3活性测定：按Caspase-3 活性检测试剂盒(R&D公司)说明书操作。简言之，按100 μg蛋白的量提取的蛋白上清液，与等体积反应缓冲液混合后用试剂盒内的蛋白稀释液将各组混合液体积调节至200 μL，分别加入96孔板内，每孔再加5 μL Caspase-3荧光底物，混匀后置37 ℃孵育2 h。以双蒸水替代蛋白上清液、反应缓冲液及底物组成的等体积混合液为对照1(C1)，以不含反应底物的混合液为对照2(C2)，以505 nm为测定波长，650 nm为参比波长，测定各孔的吸光度(OD值) 。每次实验取3 个复孔，分别进行3 次独立实验。按公式：Caspase-3相对活性=实验组OD值-(C1+C2)OD值/对照组OD 值-(C1+C2)OD值计算各组Caspase-3的相对活性 ......
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