饮食限制联合维生素D对Beclin1表达的诱导作用(1)
摘要：目的 探讨维生素D联合饮食限制诱导细胞自噬的发生以及对自噬相关蛋白Beclin1表达的影响。方法 将18月老龄大鼠随机分为对照组、维生素D组、饮食限制组、维生素D联合饮食限食组，喂养6个月后，透视电镜观察大鼠肝脏细胞中的自噬体，免疫组化检测大鼠肾皮质细胞中自噬相关蛋白Beclin1的表达情况。结果 电镜下维生素D组、饮食限制组、维生素D联合饮食限制组均出现自噬细胞形态学改变。免疫组化显示，与对照组相比，维生素D组、饮食限制组、维生素D联合饮食限制组Beclin1蛋白表达的比值均明显提高(P<0.01)，且维生素D联合饮食限制组Beclin1蛋白的表达高于维生素D组、饮食限制组(P<0.01)。结论 两种不同的检测细胞自噬方法证实，维生素D以及维生素D联合饮食限制均可增强细胞发生自体吞噬，且维生素D联合饮食限制比单独维生素D或者单独饮食限制引起自噬的程度更高，提示维生素D与饮食限制可能通过不同的信号转导途径来诱导细胞自噬的发生。
关键词：自噬；维生素D；饮食限制；Beclin1蛋白
, 百拇医药
中图分类号：R329.1 文献标识码：A
自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，是生物在其发育、老化过程中都存在的一个净化自身多余或受损细胞器的共同机制。生命体籍此维持蛋白代谢平衡及细胞环境稳定[1]。Beclin1参与自噬泡的形成过程，是新近被发现的哺乳动物调控自噬性细胞死亡途径的关键基因[2]。饮食限制(dietary restriction，DR)是指在提供生物体充分的营养成分如必需氨基酸、维生素等，保证生物体不发生营养不良的情况下，限制每日摄取的总热量[1]。维生素D的激活形式1，25-(OH)2D3作为一种多效型激素在人体许多不同的细胞中调控着将近900多种不同的基因表达，并调控他们的增殖、分化与存活[3-7]。
本研究旨在饮食限制以及维生素D(VD)干预的情况下，观察老龄大鼠中自噬相关基因Beclin1的表达和自噬小体的比例，研究饮食限制联合维生素D对细胞自噬的影响，探索饮食限制与维生素D是否通过不同的信号转导途径来诱导细胞自噬的发生。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验动物和主要试剂 山西医科大学动物实验中心购进40只18月的老龄大鼠，JEM-100CX II型透射电镜(日本日立HITACHI公司 H-600)，超薄切片机(瑞典LKB公司 LKB-Ⅴ)，活性VD(纯度为99%)购自Sigma公司，Beclin 1兔抗大鼠单克隆抗体、EnVision抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒均购自武汉博士德公司。
1.2 动物处理 40只18月老龄大鼠经洗脱期后随机分为4组，对照组、饮食限制组(DR组)、维生素D组(VD组)、维生素D联合饮食限制组(DR联合VD组)，喂养6个月，每周测大鼠体重，灌胃VD 3 μg/kg。
1.3 投射电镜检测自噬小体 经过常规取材、双重固定、脱水、浸透、包埋、切片(厚度为50 nm)，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色后，透射电镜观察、拍照、记录。
, 百拇医药
1.4 免疫组化观察肾皮质细胞Beclin1蛋白的表达 采用免疫组化法检测，组织蜡块切片，烤片后脱蜡和水化，高压抗原修复，依次滴加过氧化物酶阻断液(37 ℃封闭40 min)、体积分数10%非免疫血清(37 ℃孵育40 min)、第一抗体(稀释度均为1∶50，4 ℃过夜)，生物素标记的第二抗体(37 ℃孵育20 min)及链酶亲和素-生物素-辣根过氧化物酶工作液(37 ℃孵育20 min)，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。用已知阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。
1.5 统计学处理 采用 SPSS 17.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，各组细胞自噬泡比值和Beclin1的表达采用单因素方差分析，两组之间的进一步比较采用t检验，检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 电镜观察 自噬体为单层或双层膜包裹着的处于不同降解阶段的胞浆成分或废弃的细胞器经消化降解后形成的板层样结构。透射电镜下正常组肝脏细胞内脂滴较多，线粒体嵴结构清晰，自噬体少见。限食组肝脏细胞内线粒体丰富，肿胀明显，自噬体数量较多。维生素D组肝脏细胞线粒体丰富，线粒体体积增大，自噬体数量较多。维生素D组联合饮食限制组线粒体明显肿胀，出现大量自噬体。详见图1、表1。
, http://www.100md.com
2.2 免疫组化显示Beclin1蛋白表达增高 与对照组相比，DR组、VD组、DR联合VD组肾皮质细胞中Beclin1的表达明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)，且DR联合VD组Beclin1蛋白的表达高于DR组、VD组(P<0.01)。详见表2。
3 讨 论
大量实验表明饮食限制可以引起细胞自噬，是除遗传操作以外强有力的延缓衰老方法，被称为衰老研究领域重大的发现[8]。近年来有实验发现活性维生素D也能够引起细胞自噬，成为自噬与衰老领域新的研究热点，但目前的研究尚不清楚二者是否通过相同的信号转导途径引起细胞自噬。
自噬主要的生理功能是将胞质中的大分子物质(如蛋白质、RNA、过量储存的糖原等)和一些细胞内源性底物(包括由于生理或病理原因引起的衰老、破损的细胞器)在单位膜包裹的囊泡中大量降解，实现再循环，以维持细胞自身的稳定。这个过程对于细胞成分更新、保持旺盛的生理状态是至关重要的[9]。自噬过程的信号调控目前有以下几种：mTOR信号途径、ClassⅠPI3K/PKB途径、Gi3蛋白和氨基酸等。随着年龄的增长，细胞自噬作用开始减弱，细胞适应外界环境和自身防御反应的能力降低，损伤的细胞结构及大量氧自由基等不能有效地被清除，细胞稳态发生变化，加速细胞老化[10]。Beclin1是酵母菌atg/vps40基因在哺乳动物中的同源物，参与自噬泡的形成过程，是新近发现的哺乳动物调控自噬性细胞死亡途径的关键基因[8]。Beclin1基因在多种正常组织中均有表达，因此可以通过检测Beclin1蛋白的表达来间接反映自噬发生的强度。, 百拇医药(武海燕等)
关键词：自噬；维生素D；饮食限制；Beclin1蛋白
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中图分类号：R329.1 文献标识码：A
自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，是生物在其发育、老化过程中都存在的一个净化自身多余或受损细胞器的共同机制。生命体籍此维持蛋白代谢平衡及细胞环境稳定[1]。Beclin1参与自噬泡的形成过程，是新近被发现的哺乳动物调控自噬性细胞死亡途径的关键基因[2]。饮食限制(dietary restriction，DR)是指在提供生物体充分的营养成分如必需氨基酸、维生素等，保证生物体不发生营养不良的情况下，限制每日摄取的总热量[1]。维生素D的激活形式1，25-(OH)2D3作为一种多效型激素在人体许多不同的细胞中调控着将近900多种不同的基因表达，并调控他们的增殖、分化与存活[3-7]。
本研究旨在饮食限制以及维生素D(VD)干预的情况下，观察老龄大鼠中自噬相关基因Beclin1的表达和自噬小体的比例，研究饮食限制联合维生素D对细胞自噬的影响，探索饮食限制与维生素D是否通过不同的信号转导途径来诱导细胞自噬的发生。
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1 材料与方法
1.1 实验动物和主要试剂 山西医科大学动物实验中心购进40只18月的老龄大鼠，JEM-100CX II型透射电镜(日本日立HITACHI公司 H-600)，超薄切片机(瑞典LKB公司 LKB-Ⅴ)，活性VD(纯度为99%)购自Sigma公司，Beclin 1兔抗大鼠单克隆抗体、EnVision抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒均购自武汉博士德公司。
1.2 动物处理 40只18月老龄大鼠经洗脱期后随机分为4组，对照组、饮食限制组(DR组)、维生素D组(VD组)、维生素D联合饮食限制组(DR联合VD组)，喂养6个月，每周测大鼠体重，灌胃VD 3 μg/kg。
1.3 投射电镜检测自噬小体 经过常规取材、双重固定、脱水、浸透、包埋、切片(厚度为50 nm)，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色后，透射电镜观察、拍照、记录。
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1.4 免疫组化观察肾皮质细胞Beclin1蛋白的表达 采用免疫组化法检测，组织蜡块切片，烤片后脱蜡和水化，高压抗原修复，依次滴加过氧化物酶阻断液(37 ℃封闭40 min)、体积分数10%非免疫血清(37 ℃孵育40 min)、第一抗体(稀释度均为1∶50，4 ℃过夜)，生物素标记的第二抗体(37 ℃孵育20 min)及链酶亲和素-生物素-辣根过氧化物酶工作液(37 ℃孵育20 min)，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。用已知阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。
1.5 统计学处理 采用 SPSS 17.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，各组细胞自噬泡比值和Beclin1的表达采用单因素方差分析，两组之间的进一步比较采用t检验，检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 电镜观察 自噬体为单层或双层膜包裹着的处于不同降解阶段的胞浆成分或废弃的细胞器经消化降解后形成的板层样结构。透射电镜下正常组肝脏细胞内脂滴较多，线粒体嵴结构清晰，自噬体少见。限食组肝脏细胞内线粒体丰富，肿胀明显，自噬体数量较多。维生素D组肝脏细胞线粒体丰富，线粒体体积增大，自噬体数量较多。维生素D组联合饮食限制组线粒体明显肿胀，出现大量自噬体。详见图1、表1。
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2.2 免疫组化显示Beclin1蛋白表达增高 与对照组相比，DR组、VD组、DR联合VD组肾皮质细胞中Beclin1的表达明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)，且DR联合VD组Beclin1蛋白的表达高于DR组、VD组(P<0.01)。详见表2。
3 讨 论
大量实验表明饮食限制可以引起细胞自噬，是除遗传操作以外强有力的延缓衰老方法，被称为衰老研究领域重大的发现[8]。近年来有实验发现活性维生素D也能够引起细胞自噬，成为自噬与衰老领域新的研究热点，但目前的研究尚不清楚二者是否通过相同的信号转导途径引起细胞自噬。
自噬主要的生理功能是将胞质中的大分子物质(如蛋白质、RNA、过量储存的糖原等)和一些细胞内源性底物(包括由于生理或病理原因引起的衰老、破损的细胞器)在单位膜包裹的囊泡中大量降解，实现再循环，以维持细胞自身的稳定。这个过程对于细胞成分更新、保持旺盛的生理状态是至关重要的[9]。自噬过程的信号调控目前有以下几种：mTOR信号途径、ClassⅠPI3K/PKB途径、Gi3蛋白和氨基酸等。随着年龄的增长，细胞自噬作用开始减弱，细胞适应外界环境和自身防御反应的能力降低，损伤的细胞结构及大量氧自由基等不能有效地被清除，细胞稳态发生变化，加速细胞老化[10]。Beclin1是酵母菌atg/vps40基因在哺乳动物中的同源物，参与自噬泡的形成过程，是新近发现的哺乳动物调控自噬性细胞死亡途径的关键基因[8]。Beclin1基因在多种正常组织中均有表达，因此可以通过检测Beclin1蛋白的表达来间接反映自噬发生的强度。, 百拇医药(武海燕等)