气体信号分子硫化氢对冠心病的保护作用机制及相关性研究(1)
摘要：目的 探讨冠心病患者血浆中硫化氢(H2s)浓度与冠心病相关性及保护作用、相关代谢酶活性机制。方法 入选2012年1月—2014年6月在广东医学院附属医院心内科住院患者200例，分为两组：冠脉正常组(a 组，n=99)、冠心病组(b 组，n=101)，再亚组分为稳定型心绞痛组(b1组，n=34)、不稳定型心绞痛组(b2组，n=35)及心肌梗死组(b3组，n=32)。各组常规抽取临床指标、检测血小板聚集率，检测胱硫醚γ裂解酶(CSE)及胱硫醚β合成酶(CBS)活性，检测H2S含量，评估患者血浆中H2S的浓度与冠心病的相关性，作H2S与血小板聚集功能的相关性分析。结果 冠心病组血浆CSE及CBS活性明显低于冠脉正常组(P<0.01)，且稳定型心绞痛组、不稳定型心绞痛组及心肌梗死组血浆CSE、CBS活性存在统计学意义(P<0.01)；冠心病患者组血浆H2S含量明显低于冠脉正常组(P<0.01)，且稳定型心绞痛组、不稳定型心绞痛组及心肌梗死组血浆H2S含量存在统计学意义(P<0.01)；血浆H2S浓度与血小板聚集率呈负相关(r=-0.85，P<0.01)。结论 H2S气体浓度的改变与代谢通路中CSE 及CBS活性的降低有关，血浆H2S含量的减少可能与冠心病的病情严重程度相关，且与冠心病危险因素吸烟、高血压、高血糖密切相关。H2S 作为一种新型的气体信号分子具有心脏保护作用。
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关键词：冠心病；硫化氢；胱硫醚β合成酶；胱硫醚γ 合成酶
中图分类号：R544.1R255.3 文献标识码：B
文章编号：16721349(2015)03029804
硫化氢(H2S) 被证实具有舒张血管、减轻炎症反应、减少心肌梗死的范围和死亡率，保护神经细胞免于氧化应激的作用。H2S主要是通过L半胱氨酸或同型半胱氨酸为底物，通过胱硫醚γ裂解酶(CSE)或胱硫醚β裂解酶，以吡多醛5’磷酸盐和3硫基丙酮酸硫转移酶(3MST)为协同因子参与反应合成。在H2S 的产生中涉及CBS、CSE 及3MST，这些酶具有组织的特异性。在硫化氢的代谢通路中，起关键作用的限速酶是胱硫醚β合成酶(CBS)。本研究测定经冠脉造影证实正常对照组和冠心病组空腹血浆中硫化氢的含量，评估患者血浆中硫化氢浓度与冠心病的相关性；评估硫化氢与血小板聚集功能的相关性；探究硫化氢气体浓度的改变是否与代谢通路中代谢酶活性的改变有关。
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1 资料与方法
1.1 分组 入选2012年1月—2014年6月在广东医学院附属医院心内科住院的 200 例患者，分为两组：冠脉正常组(a 组，n=99)、冠脉造影提示冠状动脉血管光滑，无明显管腔狭窄(正常)或冠状动脉无明显影响血流动力学的粥样硬化病变(小于 50%狭窄)；冠心病组(b 组，n=101)、冠脉造影证实的管腔直径狭窄>50%狭窄，b组分为稳定型心绞痛组(b1组，n=34)、不稳定型心绞痛组(b2组，n=35)及心肌梗死组(b3组，n=32)。
1.2 入选排除标准 入选标准：拟行冠脉造影；年龄>18岁；签署知情同意书。排除标准：血流动力学不稳定；妊娠；伴有严重感染；肝功能实验室指标超过正常范围上限 2 倍者；血清肌酐大于 4.0 mg/dL；严重精神疾患者；出血病史或凝血功能障碍；血小板数小于正常值下限；预期寿命小于1年者。
1.3 研究方法
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1.3.1 血标本留取和保存 a组和b组常规抽取临床指标：血小板计数、血小板聚集率检测、三酰甘油、胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白。另空腹抽取 4 mL 全血，放置于EDTA 抗凝管中，于3 000 转，10 min分离为血浆和血细胞，放置于-80 ℃低温冰箱保存。
1.3.2 胱硫醚γ裂解酶活性检测 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗CTH 抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗CTH 抗体、HRP 标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的CTH 呈正相关。用酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度(OD值)，计算样本浓度。
1.3.3 胱硫醚β合成酶活性检测 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗CBS 抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗CBS 抗体、HRP 标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的CBS 呈正相关。用酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度(OD值)，计算样本浓度。
, 百拇医药
1.3.4 血浆中H2S含量的测定 采用敏感硫电极法测定。仪器：离子计(PXS270 上海雷磁)、敏感硫电极(Pag/S1 上海雷磁)。抗氧化液配制：NaOH 8 g，EDTA 7 g加去离子水85 mL，配制成存储液，临使用前加入抗坏血酸10 g，即抗氧化液。测定a 组和b 组血浆中H2S 的浓度：取人空腹血浆加入等体积抗氧化液，其总量应以加入测定容器后能淹没过电极为准(通常需>0.8 mL)，测定后据标准曲线计算出H2S 浓度。
1.4 统计学处理 采用SPSS 软件，使用两独立样本的t检验，使用回归分析评估患者血浆中硫化氢的浓度与冠心病的相关性及与血小板聚集功能的相关性。
2 结 果
2.1 基线资料 200例患者中，男性109例；年龄(62±12)岁。详见表1。
2.2 血浆CSE活性测定 冠心病患者组血浆CSE活性明显低于冠脉正常组(P<0.01)，且稳定型心绞痛组、不稳定型心绞痛组及心肌梗死组血浆CSE活性存在统计学意义(P<0.01)。详见表2。
2.3 胱硫醚β合成酶活性检测 冠心病组血浆CBS活性明显低于冠脉正常组(P<0.01)，且稳定型心绞痛组、不稳定型心绞痛组及心肌梗死组血浆CBS活性存在统计学意义(P<0.01)。详见表3。, 百拇医药(何松坚等)
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关键词：冠心病；硫化氢；胱硫醚β合成酶；胱硫醚γ 合成酶
中图分类号：R544.1R255.3 文献标识码：B
文章编号：16721349(2015)03029804
硫化氢(H2S) 被证实具有舒张血管、减轻炎症反应、减少心肌梗死的范围和死亡率，保护神经细胞免于氧化应激的作用。H2S主要是通过L半胱氨酸或同型半胱氨酸为底物，通过胱硫醚γ裂解酶(CSE)或胱硫醚β裂解酶，以吡多醛5’磷酸盐和3硫基丙酮酸硫转移酶(3MST)为协同因子参与反应合成。在H2S 的产生中涉及CBS、CSE 及3MST，这些酶具有组织的特异性。在硫化氢的代谢通路中，起关键作用的限速酶是胱硫醚β合成酶(CBS)。本研究测定经冠脉造影证实正常对照组和冠心病组空腹血浆中硫化氢的含量，评估患者血浆中硫化氢浓度与冠心病的相关性；评估硫化氢与血小板聚集功能的相关性；探究硫化氢气体浓度的改变是否与代谢通路中代谢酶活性的改变有关。
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1 资料与方法
1.1 分组 入选2012年1月—2014年6月在广东医学院附属医院心内科住院的 200 例患者，分为两组：冠脉正常组(a 组，n=99)、冠脉造影提示冠状动脉血管光滑，无明显管腔狭窄(正常)或冠状动脉无明显影响血流动力学的粥样硬化病变(小于 50%狭窄)；冠心病组(b 组，n=101)、冠脉造影证实的管腔直径狭窄>50%狭窄，b组分为稳定型心绞痛组(b1组，n=34)、不稳定型心绞痛组(b2组，n=35)及心肌梗死组(b3组，n=32)。
1.2 入选排除标准 入选标准：拟行冠脉造影；年龄>18岁；签署知情同意书。排除标准：血流动力学不稳定；妊娠；伴有严重感染；肝功能实验室指标超过正常范围上限 2 倍者；血清肌酐大于 4.0 mg/dL；严重精神疾患者；出血病史或凝血功能障碍；血小板数小于正常值下限；预期寿命小于1年者。
1.3 研究方法
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1.3.1 血标本留取和保存 a组和b组常规抽取临床指标：血小板计数、血小板聚集率检测、三酰甘油、胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白。另空腹抽取 4 mL 全血，放置于EDTA 抗凝管中，于3 000 转，10 min分离为血浆和血细胞，放置于-80 ℃低温冰箱保存。
1.3.2 胱硫醚γ裂解酶活性检测 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗CTH 抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗CTH 抗体、HRP 标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的CTH 呈正相关。用酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度(OD值)，计算样本浓度。
1.3.3 胱硫醚β合成酶活性检测 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗CBS 抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗CBS 抗体、HRP 标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的CBS 呈正相关。用酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度(OD值)，计算样本浓度。
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1.3.4 血浆中H2S含量的测定 采用敏感硫电极法测定。仪器：离子计(PXS270 上海雷磁)、敏感硫电极(Pag/S1 上海雷磁)。抗氧化液配制：NaOH 8 g，EDTA 7 g加去离子水85 mL，配制成存储液，临使用前加入抗坏血酸10 g，即抗氧化液。测定a 组和b 组血浆中H2S 的浓度：取人空腹血浆加入等体积抗氧化液，其总量应以加入测定容器后能淹没过电极为准(通常需>0.8 mL)，测定后据标准曲线计算出H2S 浓度。
1.4 统计学处理 采用SPSS 软件，使用两独立样本的t检验，使用回归分析评估患者血浆中硫化氢的浓度与冠心病的相关性及与血小板聚集功能的相关性。
2 结 果
2.1 基线资料 200例患者中，男性109例；年龄(62±12)岁。详见表1。
2.2 血浆CSE活性测定 冠心病患者组血浆CSE活性明显低于冠脉正常组(P<0.01)，且稳定型心绞痛组、不稳定型心绞痛组及心肌梗死组血浆CSE活性存在统计学意义(P<0.01)。详见表2。
2.3 胱硫醚β合成酶活性检测 冠心病组血浆CBS活性明显低于冠脉正常组(P<0.01)，且稳定型心绞痛组、不稳定型心绞痛组及心肌梗死组血浆CBS活性存在统计学意义(P<0.01)。详见表3。, 百拇医药(何松坚等)