睾丸精子卵母细胞浆内注射治疗梗阻性无精子症所致不育的临床体会
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【第一作者简介】孙鹏达(1972-)，女，辽宁沈阳人，主治医师，主要研究方向为生殖医学。
【摘要】目的:探讨睾丸精子单精子卵母细胞浆内注射(ICSI)治疗梗阻性无精子症所致的男性不育的疗效，以完善辅助生殖技术。方法：选男性不育症夫妇905例分成两组：ICSI组和TESE+ICSI组。ICSI组自行排精后精液内可以找到正常形态活精子的少精症患者行ICSI治疗共863例，TESE+ICSI组经附睾抽吸取精失败而睾丸切开后可找到形态正常活精子的梗阻性无精子症患者用睾丸内精子行ICSI治疗共42例，两组患者的女方均给予超促排卵用药后获取卵母细胞。结果：ICSI组863周期，获得卵子9650个，其中成熟卵母细胞7879个，ICSI7879个，移植808个周期，妊娠256例，妊娠率为31.68%。TESE+ICSI组42周期，获得卵子567个，其中成熟卵母细胞479个，ICSI479个，移植42个周期，妊娠20例，妊娠率为47.60%。对两组的受精率、优质胚胎获得率、临床妊娠率进行比较及统计学分析，TESE+ICSI组的受精率稍低于ICSI组(P0.05)。结论：睾丸切开取精子进行ICSI治疗同样能够得到较高的受精率、优质胚胎获得率和临床妊娠率。
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【关键词】睾丸精子；单精子卵母细胞浆内注射；少精症；梗阻性无精症
梗阻性无精子症大多数由输精道梗阻所致，输精道梗阻不育是男性不育症的一种常见病因，占男性不育病因的5%~15%[1]。输精道不仅是精子的通路，而且具有使精子成熟和获得活动力的功能，各种原因使曲细精管至射精管路发生梗阻均可引起输精管道梗阻性不育。ICSI技术的出现，使体外受精-胚胎移植技术得到进一步完善，解决了严重男性因素所至不育的难题，尤其是那些梗阻性无精症的患者。以下探讨睾丸切开取精结合ICSI治疗梗阻性无精子症的临床疗效。
1资料与方法
1.1研究对象
2001年8月~2005年12月在东方医疗集团生殖中心就诊的男性不育症夫妇905例，其中863例为少精症患者，平均年龄为33.43±5.19岁。42例梗阻性无精症患者经附睾抽吸失败后行睾丸活检可找到活精子，平均年龄为31.29±4.74岁。两组患者的女方经常规检查均未见明显异常。
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1.2方法
女方于月经的第21天给予GnRHa(促性腺激素释放激素激动剂)1.875mg肌肉注射，下次月经的第三天起给予FSH/HMG超促排卵用药，B超监卵泡成熟后肌肉注射HCG10000U36h后取卵，将取出的卵子放在37℃、5%CO2的培养箱内抚育4~5h。
1.3精子的采集
ICSI组行手淫法取精后给予常规处理。TESE+ICSI组局部麻醉下行睾丸切开取出少量曲细精管用1mlBD注射器(新加坡Bection.Bickinson公司)在10倍显微镜下撕开后，放在200倍的倒置显微镜下找到活精子，再放在培养基(Quinn′s，美国)中,以3000r/min离心5h后搭桥处理。
1.4ICSI的操作过程
将已抚育后的卵子，用含80KIU/L透明质酸酶(Quinn′s，美国)的受精培养液(ART-1020，Quinn′s，美国)消化颗粒细胞，反复吸卵-冠-丘复合物(OCCC)，以去除卵子上的颗粒细胞。将卵子移入装有ART-1020的培养皿(3037)中培养至少一个小时。用显微注射针制动精子尾部，确认精子已被制动。将卵子置于相差倒置显微镜的恒温台(37℃)，在200~400的放大倍数下选择MⅡ卵子，用显微固定针固定卵子，使第一极体位于6点或12点的位置，将精子的显微注射针从3点方位穿入透明带刺入卵细胞内，回抽部分胞质，确认胞膜破裂后将回抽的部分胞质和精子注入卵胞浆内，然后缓慢退针。
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1.5胚胎移植
显微注射后16~18h观察受精情况后将胚胎移至卵裂培养基(ART-1026，Quinn′s，美国)中继续培养至移植，移植前综合Puissant等[2]的评分标准对每个胚胎进行评分，3~4分均为优质胚胎，取卵后48~72h选择评分较高的胚胎2~3个移植至宫腔内，移植后给予黄体酮和HCG进行黄体支持。移植后20天验血HCG确定是否妊娠，妊娠者于移植后30天查B超确定是否为宫内妊娠。
1.6统计学资料
采用χ2检验，t检验。
2结果
两组的疗效比较结果见表1。
由此表可见ICSI组863周期,ICSI数目为7879个，受精数目为6021个，受精率为76.42%，优质胚胎获得数为3511个,优质胚胎获得率为58.31%,共妊娠256例,临床妊娠率为31.68%。TESA+ICSI组42周期，ICSI数目为479个，受精数目为351个，受精率为73.28%，优质胚胎获得数为207个，优质胚胎获得率为58.97%，共妊娠20例，临床妊娠率为47.60%例。经统计学分析ICSI组的受精率较TESE+ICSI组有所提高，差异显著(P0.05)。而临床妊娠率TESE+ICSI组47.62%较ICSI组31.68%有显著提高，但经统计学分析却无显著性差异(P>0.05),这与TESE+ICSI组的例数相对较少有关。
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TESE+ICSI组较高的妊娠率仍然有着重要的实际应用价值。临床工作中发现，此组患者明确诊断后都能果断决定采取相应的治疗手段，所以患者年龄相对较轻，尤其女方年龄大多数处于生育高峰期，而这对妊娠率的提高起着决定性的作用。ICSI组的许多患者不能立即接受ICSI的治疗手段，而经历了漫长的治疗过程，希望通
过药物治疗提高精子质量获得自然妊娠的机会，从而导致年龄相对较大，甚至有些夫妇女方年龄已过了生育高峰期。经统计学分析TESE+ICSI组的年龄的确较ICSI组轻，差异显著(P[3]。目前已被国内外的许多生殖中心所采用。据Schlegel[4]等研究显示，不同来源的精子对ICSI的受精率无明显影响，但是严重畸形精子注射后获得的胚胎着床能力明显下降，不活动精子注射后受精率大为降低。所以，要求实验员在进行ICSI操作时一定要选择形态正常的活动精子。而睾丸中形态正常的活动精子未经过输精道的进一步成熟和获得能量，与卵子融合后能否激活卵子而完成受精令人困惑。研究表明[5]将精子尾部猛烈划破制动精子，有利于精子注入卵母细胞后释放卵母细胞激活因子，激活卵母细胞和促进原核形成。卵母细胞质的钙内流和波动在卵子激活中起着重要作用，而注入前回抽卵胞质可以获得高幅度的钙波动而激活卵母细胞并可确定精子注入卵胞质,从而提高受精率[6]。我中心在熟练掌握应用ICSI技术的基础上，对42例梗阻性无精症的不育患者行TESE+ICSI治疗的临床实践证明，睾丸精子与正常排出的精子行ICSI治疗其受精率有轻度降低(P[7]10%~30%的输精管缺如是由染色体或基因异常引起，11%的无精和严重少精症的病人有AZF基因缺失，所以，ICSI技术有致子代遗传生殖缺陷的可能。
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参考文献
1、2罗丽兰主编.不孕与不育[M].北京：人民卫生出版社，1999.691.
3 Palermo G,Joris H,Deveroey P,et al.Pregnancies after intracyplasmic injection of a single spermatozoo into an oocyte[J].Lancer，1992,340(1):17.
4 HarariO,Andrew Ls,BourneH,et al.Intracytoplasmic sperm injection:a major advance in the management of severe male subfertility[J].FertilSteril,1995.60:360.
5 PalermoGD.Schlegel PN,colombero LT,et al.Aggressive Spernimmobilization prior to intracytoplasmic spern injection with innature spermatozoa improus ferilization and pregnancyrates[J].Hum Reprod,1996.11(5):1023-1029.
6 Tesarik J，Sousa M.Key elements of a highly efficient intracyplasmic sperm injection technique:Ca2+ fluxes and oocyte azoospermia[J].Hum Reprod,1999,14(7):1785-1790.
7方小武,谭志伟,雷继敏,等.特发性无精子症及严重少精子症病人Y染色体微缺检测[J].中国生育健康杂志,2003.14(1):25., http://www.100md.com(孙鹏达 孙淑杰 杨逸尘)