尿炎消冲剂对细菌性前列腺炎大鼠细胞凋亡的影响
1 实验材料
1.1 实验动物
Wista健康雄性大鼠72只，体重250～300g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
1.2 实验药物
尿炎消冲剂，由黑龙江中医药大学附属慢性病门诊提供，黑卫药制字(1997)第0026号；美满霉素：批准文号：(96)卫药准字X—196(1)号，由惠氏—百宫制药有限公司生产。
1.3 实验试剂与造模细菌
原位细胞凋亡检测试剂由德国宝灵曼公司生产；标准大肠杆菌，由黑龙江中医药大学微生物教研室提供。
2 实验方法
, http://www.100md.com 2.1 动物分组、造模方法
造模前经一周适应性饲养，将72只大鼠随机分为4组，分别为空白对照组、模型对照组、美满霉素阳性对照组、尿炎消冲剂组，每组18只，除空白组，其余3组全部造模。每只大鼠分别进行乙醚麻醉。麻醉成功后，固定大鼠四肢于固定板上，剪去大鼠下腹部的毛，在下腹部前列腺体表部碘酒、酒精常规消毒。于大鼠尿生殖隔上方，腹中线行约1.5cm大小纵形切口，切口达腹腔，用镊子轻轻提起膀胱及两侧精囊，暴露附于精囊内侧的前列腺背叶，在两侧前列腺背叶包膜下分别注射预先配制好的大肠肝菌菌液各0.05ml(大肠杆菌含量1×107/ml)。回纳前列腺以原位，全层缝合腹壁肌肉、皮肤后，酒精棉球擦净切口表面血迹，造模结束。用消毒纱布包扎，放回鼠笼，均自由饮食饲养。
2.2 给药方法
造模一周后，开始按下述剂量给药：空白对照组和模型对照组给予生理盐水10ml/kg，灌胃，一日一次；阳性对照组给药剂量为美满霉素0.018g/kg，临用前用蒸馏水配制成的混悬液，灌胃，一日一次；冲剂组给予尿炎消冲剂，剂量为0.6g/kg，用蒸馏水配制成混悬液，灌胃，一日一次；各组给药时间均连续35天，每日观察其活动、进食等情况，35天后处死动物进行相关指标的检测。
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2.3 实验方法
闭合颈椎脱臼处死，立刻在无菌条件下剖开腹腔，暴露前列腺体，取背侧左叶组织，尽快投入4%多聚甲醛溶液中固定，待作细胞凋亡检测。前列腺组织切片，原位末端标记测细胞凋亡：石蜡切片厚度5μm，裱于用防脱片剂APES处理过的载玻片上，置45℃温箱烤片24小时。切片常规脱蜡至水。磷酸缓冲液(PBS0.01mol,PH7.4)冲洗5分钟/次×2。滴加蛋白酶K，消化5分钟，PBS冲洗5分钟/次×2。吸干切片周围水分，滴0.3H2O2室温15分钟以灭活内源性酶，PBS冲洗5分钟/次×2。吸干切片周围水分，滴加末端标记酶置37℃水浴30分钟，PBS冲洗5分钟/次×3。滴加抗荧光抗体，置37℃水浴30分钟，PBS冲洗5分钟/次×3。DAB显色10分钟，蒸馏水洗。甲基绿复染10分钟，蒸馏水洗。正丁醇脱水×3。二甲苯透明×2。树脂胶封固。显微镜观察。
2.4 统计方法
所有数据以均数±标准差(±s)表示，进行方t检验，进行比较。
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3 实验结果
3.1 实验大鼠的一般情况
造模后各组大鼠均有不同程度的摄食减少，精神萎靡，毛发枯黄，缺乏光泽，上述情况在一周后逐渐恢复正常。
3.2 细胞凋亡观察结果
空白组：基本未见异常，偶见凋亡细胞。模型组：腺上皮细胞大量凋亡，可见深棕黄色凋亡小体，小体之间界限清楚，上皮屏障破坏，腺腔形状不规则，少量核碎片，见到少量炎细胞。尿炎消冲剂组：见在前列腺组织上皮和间质散在分布少量凋亡细胞和小体，上皮细胞体积基本正常，腺腔大，未见炎细胞，前列腺上皮间断分布深棕黄色凋亡小体，小体之间界限清楚，上皮厚度较好，上皮屏障存在。美满霉素组：上皮可见不连续的凋亡细胞，屏障被破坏，见少量凋亡小体，散在分布在前列腺组织上皮和间质，上皮细胞体积基本正常，腺腔大。
, 百拇医药 4讨论
近年来，细胞凋亡与慢性炎症的关系日益受到重视。细胞凋亡是指在生理情况下机体自我选择和控制的积极主动的“细胞自杀”过程，即程序性细胞死亡(PCD)，表现为细胞凋亡的形态学特征，是近年来医学研究的热点。细胞死亡一般分为两种形式：坏死和凋亡。坏死是细胞受到损害时出现肿胀、破裂，细胞内容物释放到周围环境中引发一系列炎症反应的病理过程。而细胞凋亡是一种由基因控制的，以维持组织自身稳定的生理性死亡过程，它可以完整地清除机体内“多余”细胞，对维持机体细胞功能稳定方面起着关键性作用[1,2]。在某些病理情况下，一旦出现细胞死亡，就无法逆转。因此，不可避免地对机体造成严重的损害；同样，细胞凋亡失控，如某些细胞过早或延迟凋亡也会对机体造成严重的损害[3]。当前对PCD研究的重大进展是，发现其不仅是发育过程中的一种现象，而且见于多种病理状态。细胞凋亡有重要的生理和病理意义。凋亡作为生理过程有确保正常生长发育，维持内环境稳定，发挥积极的防御功能。炎症反应是机体对有害刺激正常防御反应的一部分，也是组织损伤后修复必不可少的步骤。细胞凋亡区别于坏死的重要不同点，就是凋亡的细胞能被巨噬细胞或周围组织细胞清除而不引发炎症反应，可见通过凋亡方式清除炎症灶内多核中性粒细胞和其他滞留细胞，是限制组织损伤和促进炎症吸收的重要机制。凋亡机制可有效清除炎症灶内的炎症细胞和其他增生细胞，由此防止炎症后纤维增生和瘢痕形成，否则必将导致肉芽组织增生，引起器官结构和功能障碍。
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细胞凋亡参与多种疾病的发生和发展，并受多种因素的调控，研究发现致病菌不但可引起宿主细胞的炎症坏死，又可诱发宿主细胞凋亡。细菌引起细胞凋亡的机制目前尚不十分清楚，主要与致病菌的毒力因子有关。细菌毒素是细菌致病的主要毒力因子，其作用机制是抑制蛋白合成，在细胞膜上穿孔，干扰细胞信号转导。凋亡的缺陷还可能是由刚出现的轻微病变进展成为严重的慢性炎症的一个主要机理。慢性炎症之所以能在体内不断生长扩散、迁延不愈，还因为炎症细胞能有效的逃避机体免疫系统的攻击。目前具有说服力的证据提示，细胞凋亡乃限制可能令机体虚弱的免疫应答强度的一个中心调控关卡。越来越多的证据提示，当此关卡遭到破坏，致使免疫、躯体或骨髓细胞逃避凋亡应答时，就可能引起自身免疫性疾病或癌症等各种疾病。
尿炎消冲剂为纯中药制剂，由龙胆草、栀子、黄芩、柴胡、生地、车前子、泽泻、甘草、当归、扁蓄、大黄、滑石、瞿麦、丹参、熟地等中药组成。治疗慢性前列腺炎疗效较好[4]。龙胆草泻肝经之热，柴胡泻胆经之热，黄芩、大黄、栀子、滑石清三焦之热，扁蓄、泽泻、车前泻小肠、膀胱之湿从小便出，瞿麦降心火，甘草调和药性，丹参活血，当归、熟地养血补肝肾，上药共奏，具有清肝利胆除湿，活血化瘀补肝肾之功。中医学认为，人是一个有机的整体，局部的病变可能是机体整体水平的失衡，主张从整体观人手，综合调理。目前对慢性前列腺炎病因病机形成的共识是湿热毒邪为病之标，贯穿于疾病的全过程，肾虚是病之本，瘀血浊邪阻滞为病之渐，病至后期往往湿热毒、虚、瘀三者并存、错综复杂。治法上采用清热利湿解毒、活血化瘀、补肾益气养血综合调理，上述治法既调节机体整体状况，又针对前列腺局部的病理变化。治法特点上既有标本兼治、缓急，又有消补兼施，治法手段与用药途径多种多样。尿炎消冲剂可调控模型大鼠前列腺的细胞凋亡，有利于恢复上皮屏障作用，清除炎细胞和坏死组织，对前列腺炎有很好的疗效。
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参考文献
1 Thompson CB.Apoptosis in the Rathogenesis and treatment of disease[J]. Science, 1995,267：1456-1459.
2 Tomei LD，et al. Apoptosis in C3H/IOTl/2 mouse embryonic cell：evidence for internucleosomal DNA modification in the absence of double-strand cleavage[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90：853.
3 Buttle MT，et al.oxidative stress as a mediator of apoptosis[J]. 1mmunol Today,l994,15(1)：7-10.
4 毕焕洲,吴童,常丽娜，等.尿炎消冲剂合电针治疗慢性前列腺炎临床观察[J]. 针灸临床杂志,2003,19(11):35-36.
[收稿日期：2007-01-15], 百拇医药(毕焕洲 安瑞华)
1.1 实验动物
Wista健康雄性大鼠72只，体重250～300g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
1.2 实验药物
尿炎消冲剂，由黑龙江中医药大学附属慢性病门诊提供，黑卫药制字(1997)第0026号；美满霉素：批准文号：(96)卫药准字X—196(1)号，由惠氏—百宫制药有限公司生产。
1.3 实验试剂与造模细菌
原位细胞凋亡检测试剂由德国宝灵曼公司生产；标准大肠杆菌，由黑龙江中医药大学微生物教研室提供。
2 实验方法
, http://www.100md.com 2.1 动物分组、造模方法
造模前经一周适应性饲养，将72只大鼠随机分为4组，分别为空白对照组、模型对照组、美满霉素阳性对照组、尿炎消冲剂组，每组18只，除空白组，其余3组全部造模。每只大鼠分别进行乙醚麻醉。麻醉成功后，固定大鼠四肢于固定板上，剪去大鼠下腹部的毛，在下腹部前列腺体表部碘酒、酒精常规消毒。于大鼠尿生殖隔上方，腹中线行约1.5cm大小纵形切口，切口达腹腔，用镊子轻轻提起膀胱及两侧精囊，暴露附于精囊内侧的前列腺背叶，在两侧前列腺背叶包膜下分别注射预先配制好的大肠肝菌菌液各0.05ml(大肠杆菌含量1×107/ml)。回纳前列腺以原位，全层缝合腹壁肌肉、皮肤后，酒精棉球擦净切口表面血迹，造模结束。用消毒纱布包扎，放回鼠笼，均自由饮食饲养。
2.2 给药方法
造模一周后，开始按下述剂量给药：空白对照组和模型对照组给予生理盐水10ml/kg，灌胃，一日一次；阳性对照组给药剂量为美满霉素0.018g/kg，临用前用蒸馏水配制成的混悬液，灌胃，一日一次；冲剂组给予尿炎消冲剂，剂量为0.6g/kg，用蒸馏水配制成混悬液，灌胃，一日一次；各组给药时间均连续35天，每日观察其活动、进食等情况，35天后处死动物进行相关指标的检测。
, 百拇医药
2.3 实验方法
闭合颈椎脱臼处死，立刻在无菌条件下剖开腹腔，暴露前列腺体，取背侧左叶组织，尽快投入4%多聚甲醛溶液中固定，待作细胞凋亡检测。前列腺组织切片，原位末端标记测细胞凋亡：石蜡切片厚度5μm，裱于用防脱片剂APES处理过的载玻片上，置45℃温箱烤片24小时。切片常规脱蜡至水。磷酸缓冲液(PBS0.01mol,PH7.4)冲洗5分钟/次×2。滴加蛋白酶K，消化5分钟，PBS冲洗5分钟/次×2。吸干切片周围水分，滴0.3H2O2室温15分钟以灭活内源性酶，PBS冲洗5分钟/次×2。吸干切片周围水分，滴加末端标记酶置37℃水浴30分钟，PBS冲洗5分钟/次×3。滴加抗荧光抗体，置37℃水浴30分钟，PBS冲洗5分钟/次×3。DAB显色10分钟，蒸馏水洗。甲基绿复染10分钟，蒸馏水洗。正丁醇脱水×3。二甲苯透明×2。树脂胶封固。显微镜观察。
2.4 统计方法
所有数据以均数±标准差(±s)表示，进行方t检验，进行比较。
, 百拇医药
3 实验结果
3.1 实验大鼠的一般情况
造模后各组大鼠均有不同程度的摄食减少，精神萎靡，毛发枯黄，缺乏光泽，上述情况在一周后逐渐恢复正常。
3.2 细胞凋亡观察结果
空白组：基本未见异常，偶见凋亡细胞。模型组：腺上皮细胞大量凋亡，可见深棕黄色凋亡小体，小体之间界限清楚，上皮屏障破坏，腺腔形状不规则，少量核碎片，见到少量炎细胞。尿炎消冲剂组：见在前列腺组织上皮和间质散在分布少量凋亡细胞和小体，上皮细胞体积基本正常，腺腔大，未见炎细胞，前列腺上皮间断分布深棕黄色凋亡小体，小体之间界限清楚，上皮厚度较好，上皮屏障存在。美满霉素组：上皮可见不连续的凋亡细胞，屏障被破坏，见少量凋亡小体，散在分布在前列腺组织上皮和间质，上皮细胞体积基本正常，腺腔大。
, 百拇医药 4讨论
近年来，细胞凋亡与慢性炎症的关系日益受到重视。细胞凋亡是指在生理情况下机体自我选择和控制的积极主动的“细胞自杀”过程，即程序性细胞死亡(PCD)，表现为细胞凋亡的形态学特征，是近年来医学研究的热点。细胞死亡一般分为两种形式：坏死和凋亡。坏死是细胞受到损害时出现肿胀、破裂，细胞内容物释放到周围环境中引发一系列炎症反应的病理过程。而细胞凋亡是一种由基因控制的，以维持组织自身稳定的生理性死亡过程，它可以完整地清除机体内“多余”细胞，对维持机体细胞功能稳定方面起着关键性作用[1,2]。在某些病理情况下，一旦出现细胞死亡，就无法逆转。因此，不可避免地对机体造成严重的损害；同样，细胞凋亡失控，如某些细胞过早或延迟凋亡也会对机体造成严重的损害[3]。当前对PCD研究的重大进展是，发现其不仅是发育过程中的一种现象，而且见于多种病理状态。细胞凋亡有重要的生理和病理意义。凋亡作为生理过程有确保正常生长发育，维持内环境稳定，发挥积极的防御功能。炎症反应是机体对有害刺激正常防御反应的一部分，也是组织损伤后修复必不可少的步骤。细胞凋亡区别于坏死的重要不同点，就是凋亡的细胞能被巨噬细胞或周围组织细胞清除而不引发炎症反应，可见通过凋亡方式清除炎症灶内多核中性粒细胞和其他滞留细胞，是限制组织损伤和促进炎症吸收的重要机制。凋亡机制可有效清除炎症灶内的炎症细胞和其他增生细胞，由此防止炎症后纤维增生和瘢痕形成，否则必将导致肉芽组织增生，引起器官结构和功能障碍。
, http://www.100md.com
细胞凋亡参与多种疾病的发生和发展，并受多种因素的调控，研究发现致病菌不但可引起宿主细胞的炎症坏死，又可诱发宿主细胞凋亡。细菌引起细胞凋亡的机制目前尚不十分清楚，主要与致病菌的毒力因子有关。细菌毒素是细菌致病的主要毒力因子，其作用机制是抑制蛋白合成，在细胞膜上穿孔，干扰细胞信号转导。凋亡的缺陷还可能是由刚出现的轻微病变进展成为严重的慢性炎症的一个主要机理。慢性炎症之所以能在体内不断生长扩散、迁延不愈，还因为炎症细胞能有效的逃避机体免疫系统的攻击。目前具有说服力的证据提示，细胞凋亡乃限制可能令机体虚弱的免疫应答强度的一个中心调控关卡。越来越多的证据提示，当此关卡遭到破坏，致使免疫、躯体或骨髓细胞逃避凋亡应答时，就可能引起自身免疫性疾病或癌症等各种疾病。
尿炎消冲剂为纯中药制剂，由龙胆草、栀子、黄芩、柴胡、生地、车前子、泽泻、甘草、当归、扁蓄、大黄、滑石、瞿麦、丹参、熟地等中药组成。治疗慢性前列腺炎疗效较好[4]。龙胆草泻肝经之热，柴胡泻胆经之热，黄芩、大黄、栀子、滑石清三焦之热，扁蓄、泽泻、车前泻小肠、膀胱之湿从小便出，瞿麦降心火，甘草调和药性，丹参活血，当归、熟地养血补肝肾，上药共奏，具有清肝利胆除湿，活血化瘀补肝肾之功。中医学认为，人是一个有机的整体，局部的病变可能是机体整体水平的失衡，主张从整体观人手，综合调理。目前对慢性前列腺炎病因病机形成的共识是湿热毒邪为病之标，贯穿于疾病的全过程，肾虚是病之本，瘀血浊邪阻滞为病之渐，病至后期往往湿热毒、虚、瘀三者并存、错综复杂。治法上采用清热利湿解毒、活血化瘀、补肾益气养血综合调理，上述治法既调节机体整体状况，又针对前列腺局部的病理变化。治法特点上既有标本兼治、缓急，又有消补兼施，治法手段与用药途径多种多样。尿炎消冲剂可调控模型大鼠前列腺的细胞凋亡，有利于恢复上皮屏障作用，清除炎细胞和坏死组织，对前列腺炎有很好的疗效。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Thompson CB.Apoptosis in the Rathogenesis and treatment of disease[J]. Science, 1995,267：1456-1459.
2 Tomei LD，et al. Apoptosis in C3H/IOTl/2 mouse embryonic cell：evidence for internucleosomal DNA modification in the absence of double-strand cleavage[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90：853.
3 Buttle MT，et al.oxidative stress as a mediator of apoptosis[J]. 1mmunol Today,l994,15(1)：7-10.
4 毕焕洲,吴童,常丽娜，等.尿炎消冲剂合电针治疗慢性前列腺炎临床观察[J]. 针灸临床杂志,2003,19(11):35-36.
[收稿日期：2007-01-15], 百拇医药(毕焕洲 安瑞华)