IVF-ET周期中控制性超促排卵对阴道微生态的影响(2)
1.2研究方法
1.2.1 取材时间 每位患者均接受2次阴道微生态检查。第1次：进入IVF-ET周期前，未经过任何激素治疗时，检查患者阴道微生态，VVC和BV者给予相应的治疗，阴道菌群正常后开始进入IVF-ET周期。第2次：在HCG注射日再次检查阴道分泌物。
1.2.2 阴道菌群检测步骤及意义 (1)取样：用无菌刮板及长棉签从研究对象阴道侧壁上1/3处取得阴道分泌物。(2)盐水湿片：直接光镜检查清洁度及有无滴虫、真菌菌丝。(3)涂片后Gram染色法染色，显微镜下检测阴道菌群。(4)用pH3.8~5.4精密试纸测定阴道pH值。(5)阴道微生物功能检测，用北京瑞美奥生物医药公司提供的试剂盒，分别检测过氧化氢酶、唾液酸苷酶和白细胞脂酶3项功能。
1.2.3阴道微生态诊断标准 依据曾忠铭等[4]1999年提出的通过菌群密集度、菌群多样性、优势菌等指标进行阴道菌群的微生态评价。(1)Gram染色后显微镜检测：①菌群密集度：根据油镜下每视野平均细菌数分为Ⅰ-Ⅳ级：Ⅰ级 1~10个/油镜，Ⅱ级10~100个/油镜，Ⅲ级100~1000个/油镜，Ⅳ级1000个以上/油镜。②菌群多样性：根据油镜下每视野能辨别的细菌菌群数分为Ⅰ-Ⅳ级，Ⅰ级 1~3种/油镜，Ⅱ级4~6种/油镜，Ⅲ级7~9种/油镜，Ⅳ级：10种以上/油镜。③优势菌：根据所见最多的微生物定义为优势菌。④VVC诊断标准：显微镜检见到假菌丝诊断为阳性。⑤BV诊断标准采用nugent评分[5]：0~3分正常,4~6分BV中间型,≥7分BV阳性。(2)阴道PH值范围为≤4.5正常，>4.5异常。
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1.2.4 微生态诊断分类 (1)微生态正常。(2)微生态失调：密集度、多样性、优势菌、炎性反应、菌群功能等任何一项出现异常，都可诊断。见表1。
1.2.5IVF-ET方法[3] 我们采用标准的GnRHa长方案：从月经的黄体中期开始使用GnRHa 0.1mg每日皮下注射，降调节14天后，超声检查子宫内膜厚度，窦卵泡数量和大小；血清FSH、LH、E2，如果降调节满意，则开始使用Gn促排卵治疗，待卵泡成熟后注射HCG，注射HCG日检查阴道菌群。36小时后取卵，取卵后3天进行胚胎移植。
1.3统计学方法
应用SPSS 10. 0软件进行数据录入和处理。计量数据以x±sd表示，差异比较采用方差分析和χ2检验，P < 0.05表明差异有统计学意义。
2 结 果
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2.1 患者的一般资料
本研究共收集患者100例，年龄21~46岁(32.02±4.58岁)。不孕年限1~20年(5.6±4.65年)，体重指数18.2~32.9(22.47±3.02)。本研究患者均采用GnRHa长方案，GnRHa降调节时间14~18天(15.1±0.36天)，患者使用Gn时间7~12天(10±1.04天)，HCG日E2值507pg/ml~8077pg/ml(3058.6±1865pg/ml)。
2.2 COH前后患者的阴道菌群情况比较
100例患者中，COH前有微生态失调者13例，其中BV 2例(2%),菌群正常功能下降9例(9%)，菌群异常2例(2%)。COH后菌群失调者42例(42%)，其中VVC患者9例(9%)，BV6例(6%)，BV中间型3例(3%)，菌群正常但功能下降15例(15%)，菌群异常9例(9%)，COH前后比较有统计学差异(P<0.05)。见表2。
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2.3 COH前阴道微生态正常与异常患者COH后微生态失调发生率的比较
100例患者中，87例COH前检查阴道菌群正常者中，COH后34例发生微生态失调(39.9%)。13例 COH前检查阴道微生态失调者中，COH后8例发生微生态失调(61.5%)，有统计学差异(P<0.05)。见表3。
3 讨 论
阴道微生态体系由阴道内微生态菌群、机体内分泌调节功能和解剖结构共同组成。正常状态下，阴道内的菌群以乳酸杆菌为优势，具有分解糖类生成乳酸，抑制其他致病菌繁殖的作用，各菌种之间相互协调，互相制约，共同形成阴道内的生物平衡体系[6]。在女性不同的生理时期，如妊娠期，绝经期，阴道内的菌群都会发生变化，阴道内的菌群受体内雌激素变化的影响[7,8, 9]。以往的研究表明，雌激素对阴道菌群的平衡起到保护作用，绝经后妇女易患阴道炎症，进行雌激素补充可以减少阴道炎症的发生[10]。在妊娠期，由于体内的雌激素水平升高，阴道内菌群也会发生变化，但发生BV和BV中间型的比例下降[11]。在产褥期，随着雌激素水平的迅速下降，发生BV和BV中间型的比例明显上升[12]。我们的研究发现，在接受COH治疗的患者中，阴道菌群失调发生率为42%(42/100)，其中BV和BV中间型9%(9/100) , VVC 9%(9/100)，菌群功能下降15%(15/100)，菌群异常9%(9/100)。这一结果提示COH过程中，雌激素的迅速升高对于阴道微生态菌群是有破坏作用的，这与以往我们认为的雌激素对阴道菌群的保护作用是相悖的。这可能是由于接受COH治疗的患者雌激素水平是在10天左右迅速升高的，有些患者的雌激素水平甚至高于妊娠期雌激素水平，这种短期内的迅速变化可能导致了阴道菌群的异常，其具体机制尚待进一步研究。
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既往对不孕症人群的研究显示，不孕症人群微生态失调的发生率与普通育龄期女性的发病率相似[13]，我们的研究发现，在COH前有阴道微生态失调的患者，COH后阴道微生态失调的发生率(61.5%)显著高于健康患者(39.9%)。这提示我们，在COH前有阴道微生态失调的患者即使治疗好转后再接受COH治疗也比健康患者更容易发生阴道微生态的失调。因此，在进行COH治疗前和取卵手术前进行阴道微生态检查是十分必要的，尤其是COH前已经有阴道菌群异常的患者更应该密切关注患者的阴道菌群状况，如果出现病原体感染应该及早治疗，减少术后的感染机会。
通常认为，患有阴道炎的患者取卵术后容易发生盆腔感染[14]。从研究结果中，我们可以看出，接受COH治疗的患者有42%发生阴道菌群失调，其中BV和VVC的患者接受药物治疗后进行取卵，取卵后无盆腔感染发生。通常，仅发生了菌群异常或菌群正常功能下降的患者不需要进行药物治疗，但菌群的变化是否会增加盆腔感染的机会尚无定论，我中心的做法是对于这部分患者取卵手术前不进行药物治疗，但要给予2~3次彻底的阴道冲洗，目前尚无取卵后盆腔感染的发生。但是由于我们选取的观察日是注射HCG日，所以2~5天后的取卵手术、胚胎移植和术后应用抗生素预防感染都可能会对阴道菌群产生进一步的影响，部分患者可能进展为BV或者VVC。在临床工作中，对于这部分病人还应密切观察患者的自觉症状，及时检查，必要时给予药物治疗。
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研究证明阴道的感染性疾病可以使IVF-ET周期的胚胎种植率下降流产率增高[15，16]，也与流产和早产有关 [17]。由于我们研究的时间较短，还有许多妊娠的患者没有度过早孕期和分娩期，阴道感染、菌群异常和菌群功能下降是否会对IVF-ET患者的胚胎着床和妊娠产生影响，目前还在观察之中。
参考文献
1 李兰娟.感染微生态学[M].北京：人民卫生出版社，2002，422-424.
2 Donati L, Di Vico A, Nucci M, et al. Vaginal microbial flora and outcome of pregnancy[J].Arch Gynecol Obstet，2010，281(4):589-600., 百拇医药(张蕾 陈菲 徐阳 廖秦平 尚菁 薛晴 张岱 赵敏 郐艳荣 蔡学泳 王晟 鞠慧岩)
1.2.1 取材时间 每位患者均接受2次阴道微生态检查。第1次：进入IVF-ET周期前，未经过任何激素治疗时，检查患者阴道微生态，VVC和BV者给予相应的治疗，阴道菌群正常后开始进入IVF-ET周期。第2次：在HCG注射日再次检查阴道分泌物。
1.2.2 阴道菌群检测步骤及意义 (1)取样：用无菌刮板及长棉签从研究对象阴道侧壁上1/3处取得阴道分泌物。(2)盐水湿片：直接光镜检查清洁度及有无滴虫、真菌菌丝。(3)涂片后Gram染色法染色，显微镜下检测阴道菌群。(4)用pH3.8~5.4精密试纸测定阴道pH值。(5)阴道微生物功能检测，用北京瑞美奥生物医药公司提供的试剂盒，分别检测过氧化氢酶、唾液酸苷酶和白细胞脂酶3项功能。
1.2.3阴道微生态诊断标准 依据曾忠铭等[4]1999年提出的通过菌群密集度、菌群多样性、优势菌等指标进行阴道菌群的微生态评价。(1)Gram染色后显微镜检测：①菌群密集度：根据油镜下每视野平均细菌数分为Ⅰ-Ⅳ级：Ⅰ级 1~10个/油镜，Ⅱ级10~100个/油镜，Ⅲ级100~1000个/油镜，Ⅳ级1000个以上/油镜。②菌群多样性：根据油镜下每视野能辨别的细菌菌群数分为Ⅰ-Ⅳ级，Ⅰ级 1~3种/油镜，Ⅱ级4~6种/油镜，Ⅲ级7~9种/油镜，Ⅳ级：10种以上/油镜。③优势菌：根据所见最多的微生物定义为优势菌。④VVC诊断标准：显微镜检见到假菌丝诊断为阳性。⑤BV诊断标准采用nugent评分[5]：0~3分正常,4~6分BV中间型,≥7分BV阳性。(2)阴道PH值范围为≤4.5正常，>4.5异常。
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1.2.4 微生态诊断分类 (1)微生态正常。(2)微生态失调：密集度、多样性、优势菌、炎性反应、菌群功能等任何一项出现异常，都可诊断。见表1。
1.2.5IVF-ET方法[3] 我们采用标准的GnRHa长方案：从月经的黄体中期开始使用GnRHa 0.1mg每日皮下注射，降调节14天后，超声检查子宫内膜厚度，窦卵泡数量和大小；血清FSH、LH、E2，如果降调节满意，则开始使用Gn促排卵治疗，待卵泡成熟后注射HCG，注射HCG日检查阴道菌群。36小时后取卵，取卵后3天进行胚胎移植。
1.3统计学方法
应用SPSS 10. 0软件进行数据录入和处理。计量数据以x±sd表示，差异比较采用方差分析和χ2检验，P < 0.05表明差异有统计学意义。
2 结 果
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2.1 患者的一般资料
本研究共收集患者100例，年龄21~46岁(32.02±4.58岁)。不孕年限1~20年(5.6±4.65年)，体重指数18.2~32.9(22.47±3.02)。本研究患者均采用GnRHa长方案，GnRHa降调节时间14~18天(15.1±0.36天)，患者使用Gn时间7~12天(10±1.04天)，HCG日E2值507pg/ml~8077pg/ml(3058.6±1865pg/ml)。
2.2 COH前后患者的阴道菌群情况比较
100例患者中，COH前有微生态失调者13例，其中BV 2例(2%),菌群正常功能下降9例(9%)，菌群异常2例(2%)。COH后菌群失调者42例(42%)，其中VVC患者9例(9%)，BV6例(6%)，BV中间型3例(3%)，菌群正常但功能下降15例(15%)，菌群异常9例(9%)，COH前后比较有统计学差异(P<0.05)。见表2。
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2.3 COH前阴道微生态正常与异常患者COH后微生态失调发生率的比较
100例患者中，87例COH前检查阴道菌群正常者中，COH后34例发生微生态失调(39.9%)。13例 COH前检查阴道微生态失调者中，COH后8例发生微生态失调(61.5%)，有统计学差异(P<0.05)。见表3。
3 讨 论
阴道微生态体系由阴道内微生态菌群、机体内分泌调节功能和解剖结构共同组成。正常状态下，阴道内的菌群以乳酸杆菌为优势，具有分解糖类生成乳酸，抑制其他致病菌繁殖的作用，各菌种之间相互协调，互相制约，共同形成阴道内的生物平衡体系[6]。在女性不同的生理时期，如妊娠期，绝经期，阴道内的菌群都会发生变化，阴道内的菌群受体内雌激素变化的影响[7,8, 9]。以往的研究表明，雌激素对阴道菌群的平衡起到保护作用，绝经后妇女易患阴道炎症，进行雌激素补充可以减少阴道炎症的发生[10]。在妊娠期，由于体内的雌激素水平升高，阴道内菌群也会发生变化，但发生BV和BV中间型的比例下降[11]。在产褥期，随着雌激素水平的迅速下降，发生BV和BV中间型的比例明显上升[12]。我们的研究发现，在接受COH治疗的患者中，阴道菌群失调发生率为42%(42/100)，其中BV和BV中间型9%(9/100) , VVC 9%(9/100)，菌群功能下降15%(15/100)，菌群异常9%(9/100)。这一结果提示COH过程中，雌激素的迅速升高对于阴道微生态菌群是有破坏作用的，这与以往我们认为的雌激素对阴道菌群的保护作用是相悖的。这可能是由于接受COH治疗的患者雌激素水平是在10天左右迅速升高的，有些患者的雌激素水平甚至高于妊娠期雌激素水平，这种短期内的迅速变化可能导致了阴道菌群的异常，其具体机制尚待进一步研究。
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既往对不孕症人群的研究显示，不孕症人群微生态失调的发生率与普通育龄期女性的发病率相似[13]，我们的研究发现，在COH前有阴道微生态失调的患者，COH后阴道微生态失调的发生率(61.5%)显著高于健康患者(39.9%)。这提示我们，在COH前有阴道微生态失调的患者即使治疗好转后再接受COH治疗也比健康患者更容易发生阴道微生态的失调。因此，在进行COH治疗前和取卵手术前进行阴道微生态检查是十分必要的，尤其是COH前已经有阴道菌群异常的患者更应该密切关注患者的阴道菌群状况，如果出现病原体感染应该及早治疗，减少术后的感染机会。
通常认为，患有阴道炎的患者取卵术后容易发生盆腔感染[14]。从研究结果中，我们可以看出，接受COH治疗的患者有42%发生阴道菌群失调，其中BV和VVC的患者接受药物治疗后进行取卵，取卵后无盆腔感染发生。通常，仅发生了菌群异常或菌群正常功能下降的患者不需要进行药物治疗，但菌群的变化是否会增加盆腔感染的机会尚无定论，我中心的做法是对于这部分患者取卵手术前不进行药物治疗，但要给予2~3次彻底的阴道冲洗，目前尚无取卵后盆腔感染的发生。但是由于我们选取的观察日是注射HCG日，所以2~5天后的取卵手术、胚胎移植和术后应用抗生素预防感染都可能会对阴道菌群产生进一步的影响，部分患者可能进展为BV或者VVC。在临床工作中，对于这部分病人还应密切观察患者的自觉症状，及时检查，必要时给予药物治疗。
, 百拇医药
研究证明阴道的感染性疾病可以使IVF-ET周期的胚胎种植率下降流产率增高[15，16]，也与流产和早产有关 [17]。由于我们研究的时间较短，还有许多妊娠的患者没有度过早孕期和分娩期，阴道感染、菌群异常和菌群功能下降是否会对IVF-ET患者的胚胎着床和妊娠产生影响，目前还在观察之中。
参考文献
1 李兰娟.感染微生态学[M].北京：人民卫生出版社，2002，422-424.
2 Donati L, Di Vico A, Nucci M, et al. Vaginal microbial flora and outcome of pregnancy[J].Arch Gynecol Obstet，2010，281(4):589-600., 百拇医药(张蕾 陈菲 徐阳 廖秦平 尚菁 薛晴 张岱 赵敏 郐艳荣 蔡学泳 王晟 鞠慧岩)