低评分胚胎发育潜能的研究
【摘要】目的：探讨低评分胚胎体外囊胚培养的发育潜能。方法：将IVF/ICSI周期中第3天的低评分胚胎进行体外囊胚培养，观察胚胎发育情况，将形成的致密桑葚胚和囊胚进行玻璃化冷冻，并进一步观察这些冷冻胚胎冻融后的临床结局。结果：613周期中2058枚低评分胚胎进行囊胚培养后共获得753枚囊胚和13枚致密桑葚胚，囊胚形成率为36.59%；共冻胚322枚，冷冻胚胎率为15.65%；其中有低胚冷冻的周期为220，冷冻周期拥有率为35.89%；54例冻融有低胚移植周期中有18例临床妊娠，临床妊娠率为33.33%。结论：将低评分胚胎进行体外囊胚培养，可以筛选出具有发育潜能的胚胎。提高胚胎利用率和累计妊娠率。
【关键词】低评分胚胎；囊胚培养
目前，绝大部分生殖中心仍用形态学评分对受精后D3的胚胎进行质量评估，从而选择优质胚胎进行移植和冷冻，剩余的形态学评分低的胚胎往往不被利用，最终选择体外退化或丢弃。随着胚胎序贯培养和玻璃化冷冻技术的发展，大家越来越关注这些低评分胚胎，不断有文献报道将这些低评分胚胎体外继续培养形成囊胚后选择达到冷冻标准的囊胚冷冻，既提高了胚胎的利用率和周期累计妊娠率，并且可利用这类废弃胚胎建立人类胚胎干细胞系。本研究对D3低评分胚胎进行体外囊胚培养，对有达到冷冻标准的致密桑葚胚及囊胚进行冷冻保存，以期获得更好的累计妊娠率，并为低评分胚胎的利用提供理论依据和技术支持。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 研究对象
胚胎来源为20lO年7月—2011年4月来我院行IVF/ICS I助孕治疗的夫妇613对，16—18h观察受精情况。D3胚胎移植后，剩余2049枚优质胚胎进行囊胚培养，获得1711枚囊胚，其中有1584枚优质囊胚冷冻，另外2058枚低质量胚胎经患者同意后转人囊胚培养液继续培养，记录发育情况，选择优质囊胚和致密桑葚胚进行玻璃化冷冻。
1.2 培养方法
1.2.1 配制囊胚培养液将血清替代品(serum proteinsubstitute，SPS，SAGE公司)以10%的浓度加入G2中，配成囊胚培养液，在35mm的培养皿中做30μl的微滴，覆盖矿物油，37℃、5%CO2培养箱中平衡过夜。
1.2.2 胚胎评分按Peter卵裂期胚胎评分系统评估D3胚胎质量。Ⅰ级：卵裂球大小均匀，形状规则，透亮，碎片<10%；Ⅱ级：卵裂球稍不均匀或形状稍不规则，胞浆有颗粒现象，碎片在10%—20%之间；Ⅲ级：卵裂球明显不均匀或形状明显不规则，胞浆有颗粒现象，碎片在20%～50%之间；Ⅳ级：卵裂球严重不均匀或形状严重不规则，胞浆有颗粒现象，碎片>50%。将第3天发育到6—10个卵裂球的Ⅰ、Ⅱ级胚胎定义为优质胚胎，其余为低评分胚胎。
, 百拇医药
1.2.3 囊胚培养及观察将D3废弃胚胎在囊胚培养液中漂洗后，转移到新鲜囊胚培养液微滴中培养至D5—6，观察胚胎发育情况，根据Garnder囊胚分级法对形成的囊胚进行分级。先根据囊胚的扩张和孵出程度将囊胚分成1～6级：1级，早期囊胚，囊胚腔体积囊胚总体积的一半；3级，完全扩张囊胚，囊胚腔占据整个囊胚；4级，扩张后囊胚，囊胚腔体积较早期囊胚明显扩大，透明带变薄；5级，正在孵化的囊胚，囊胚正在从透明带破裂口孵出；6级，孵化出的囊胚，囊胚完全从透明带中脱出。3—6级囊胚需对内细胞团和滋养外胚层细胞进行评分。ICM评分：A级，细胞数目多，结合紧密；B级，细胞数目较少，结合较松散；C级，细胞数目极少。TE评分：A级，细胞数目多，囊胚四周均有细胞分布；B级，细胞数目较少，上皮细胞较松散；C级，细胞数目极少。将D5评分≥3AA、3AB、3BA、3BB或D6—7评分≥4AA、4AB、4BA、4BB的囊胚定为优质囊胚，视为可冻存的囊胚。
1.3 统计学方法
采用SPSS统计软件包进行统计学分析，结果以百分率表示，率的比较采用X2检验，检验标准取α=0.05。
, 百拇医药
2 结果
2.1 D3不同卵裂球数低评分胚胎成囊胚的能力
来自613个周期中的低评分胚胎共2058枚，经过体外培养2—3d后，753枚形成囊胚，囊胚发育率为36.59%，获得的致密桑葚胚和囊胚予以冷冻，冷冻胚胎共322枚，胚胎利用率为15.65%，有冷冻的周期220例，冷冻胚胎周期拥有率35.89%。见表1。
2.2 低胚形成的囊胚冻融及移植后妊娠情况
220例冷冻周期目前解冻有低胚周期是54例78枚低胚培养的囊胚，其中复苏77枚移植77枚，复苏率为98.72%。移植了54例，其中18例获得临床妊娠，临床妊娠率约为33.33%，着床率约为23.38%。见表2。
2.3 囊胚形成情况与妊娠结局
, 百拇医药
低评分胚胎继续体外培养中有囊胚形成组的新鲜临床妊娠率为49.28%，无囊胚形成组的新鲜临床妊娠率为43.84%，两组间妊娠率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
3 讨论
目前在IVF—ET周期中，一般将第3天的优质胚胎进行移植或冷冻，剩余的低评分胚胎往往不被利用，但是仅仅凭第3天的胚胎形态学评分来衡量胚胎的发育潜能还无法做到足够科学和准确。胚胎形态学评分主要从胚胎的生长速率和碎片的多少来评价，胚胎的生长速率是评估胚胎潜在活力的有力指数，但生长缓慢的胚胎并非完全不具有正常妊娠的能力，有部分早期发育缓慢的胚胎在第3天以后的培养中赶上了生长的步伐，在临床上移植这样发育缓慢的低评分胚胎仍然获得妊娠并产下正常儿的例子屡见不鲜。同样，有碎片的胚胎不管修复与否，也能种植和产生足月分娩。这表明人类胚胎有高度的自我调节的能力，失去一半细胞仍然能够恢复，而且证实了成熟卵子包含有比胚胎发育需要更多的原料的普遍意见。并且，通过荧光原位杂交技术进行种植前卵裂球的基因诊断分析发现一个在总的形态学和基因正常状态之间令人奇怪的偏差，形态学最好的胚胎可能会有基因异常，而包含有碎片的评分质量一般的胚胎实际上有正常的种植潜力。本研究对613个周期中的2058个低评分胚胎进行体外继续培养，形成753个囊胚，其中冷冻了309个囊胚和13个致密桑葚胚，证明早期胚胎形态评分不能完全预测其发育潜力，体外继续培养可以进一步筛选出有发育潜能的低质量胚胎，提高胚胎利用率和累计妊娠率，最大限度节约胚胎。
, 百拇医药
研究表明人类胚胎在8细胞期之前的生长仍然是由卵细胞本身的遗传物质控制的，因此早期卵裂不能体现胚胎自身的遗传物质(Braude et al，1988)。对胚胎质量或生长潜能的评估在胚胎基因活化之后进行应该更为合理，而桑椹胚和囊胚期的胚胎已经具备了活化的胚胎基因。文献报道，形成囊胚的胚胎其染色体异常比例更低。Balaban报道了158个周期的D3期Ⅲ—Ⅳ级分裂期胚胎，继续培养到D5胚胎发育至囊胚，进行移植并观察着床率，与162个周期的同样分级的分裂期胚胎D3期直接移植比较，着床率显著增高(15%比5.9%)，提示质量差的D3期胚胎也可以通过延长体外培养时间提高着床率，为质量较差的分裂期胚胎把握移植时机提出了一个新的思路。与分裂期胚胎移植比较，囊胚移植具有更符合人类生殖生理(胚胎于囊胚期进入宫腔环境)，选择的胚胎更准确，更具潜力，能减少移植数目，降低多胎风险，第5天子宫收缩明显减少，利于胚胎着床等优点，因此质量较差的卵裂期胚胎也可考虑D5移植。
有报道认为，体外受精治疗剩余胚胎的囊胚形成情况可以间接预测妊娠结局。梁菊艳等研究显示废弃胚胎继续培养有囊胚形成的患者临床妊娠率明显高于无囊胚形成的患者，提示胚胎有较好的发育潜能，可间接预测妊娠结局。本研究结果显示，废弃胚胎有囊胚形成的患者，其临床妊娠率略高于无囊胚形成的患者，提示其胚胎可能有较好的发育潜能，但两组间并无统计学差异。
本观察还发现，一些4细胞及4细胞以下的Ⅲ—Ⅳ级胚胎，尽管含碎片较多，仍然可以形成可利用的囊胚，这种情况的出现，可能是观察的不准确造成的，目前对卵裂期的胚胎评分仅仅采用形态学的判断标准，对其中的“碎片”的评判无法做得完全客观正确，缺乏科学依据。有文献报道，对于D3的卵裂期胚胎，胚胎内直径小于40的“细胞”内通常不含遗传物质，但实际上仍有一定比例的遗传物质，也是真正的细胞。因此，为了避免这类形态学评分局限的误差，更应该将形态学评分低的胚胎进行囊胚培养，进一步筛选出优质胚胎。, 百拇医药(刘英 黄雅丹等)
【关键词】低评分胚胎；囊胚培养
目前，绝大部分生殖中心仍用形态学评分对受精后D3的胚胎进行质量评估，从而选择优质胚胎进行移植和冷冻，剩余的形态学评分低的胚胎往往不被利用，最终选择体外退化或丢弃。随着胚胎序贯培养和玻璃化冷冻技术的发展，大家越来越关注这些低评分胚胎，不断有文献报道将这些低评分胚胎体外继续培养形成囊胚后选择达到冷冻标准的囊胚冷冻，既提高了胚胎的利用率和周期累计妊娠率，并且可利用这类废弃胚胎建立人类胚胎干细胞系。本研究对D3低评分胚胎进行体外囊胚培养，对有达到冷冻标准的致密桑葚胚及囊胚进行冷冻保存，以期获得更好的累计妊娠率，并为低评分胚胎的利用提供理论依据和技术支持。
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1 资料与方法
1.1 研究对象
胚胎来源为20lO年7月—2011年4月来我院行IVF/ICS I助孕治疗的夫妇613对，16—18h观察受精情况。D3胚胎移植后，剩余2049枚优质胚胎进行囊胚培养，获得1711枚囊胚，其中有1584枚优质囊胚冷冻，另外2058枚低质量胚胎经患者同意后转人囊胚培养液继续培养，记录发育情况，选择优质囊胚和致密桑葚胚进行玻璃化冷冻。
1.2 培养方法
1.2.1 配制囊胚培养液将血清替代品(serum proteinsubstitute，SPS，SAGE公司)以10%的浓度加入G2中，配成囊胚培养液，在35mm的培养皿中做30μl的微滴，覆盖矿物油，37℃、5%CO2培养箱中平衡过夜。
1.2.2 胚胎评分按Peter卵裂期胚胎评分系统评估D3胚胎质量。Ⅰ级：卵裂球大小均匀，形状规则，透亮，碎片<10%；Ⅱ级：卵裂球稍不均匀或形状稍不规则，胞浆有颗粒现象，碎片在10%—20%之间；Ⅲ级：卵裂球明显不均匀或形状明显不规则，胞浆有颗粒现象，碎片在20%～50%之间；Ⅳ级：卵裂球严重不均匀或形状严重不规则，胞浆有颗粒现象，碎片>50%。将第3天发育到6—10个卵裂球的Ⅰ、Ⅱ级胚胎定义为优质胚胎，其余为低评分胚胎。
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1.2.3 囊胚培养及观察将D3废弃胚胎在囊胚培养液中漂洗后，转移到新鲜囊胚培养液微滴中培养至D5—6，观察胚胎发育情况，根据Garnder囊胚分级法对形成的囊胚进行分级。先根据囊胚的扩张和孵出程度将囊胚分成1～6级：1级，早期囊胚，囊胚腔体积囊胚总体积的一半；3级，完全扩张囊胚，囊胚腔占据整个囊胚；4级，扩张后囊胚，囊胚腔体积较早期囊胚明显扩大，透明带变薄；5级，正在孵化的囊胚，囊胚正在从透明带破裂口孵出；6级，孵化出的囊胚，囊胚完全从透明带中脱出。3—6级囊胚需对内细胞团和滋养外胚层细胞进行评分。ICM评分：A级，细胞数目多，结合紧密；B级，细胞数目较少，结合较松散；C级，细胞数目极少。TE评分：A级，细胞数目多，囊胚四周均有细胞分布；B级，细胞数目较少，上皮细胞较松散；C级，细胞数目极少。将D5评分≥3AA、3AB、3BA、3BB或D6—7评分≥4AA、4AB、4BA、4BB的囊胚定为优质囊胚，视为可冻存的囊胚。
1.3 统计学方法
采用SPSS统计软件包进行统计学分析，结果以百分率表示，率的比较采用X2检验，检验标准取α=0.05。
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2 结果
2.1 D3不同卵裂球数低评分胚胎成囊胚的能力
来自613个周期中的低评分胚胎共2058枚，经过体外培养2—3d后，753枚形成囊胚，囊胚发育率为36.59%，获得的致密桑葚胚和囊胚予以冷冻，冷冻胚胎共322枚，胚胎利用率为15.65%，有冷冻的周期220例，冷冻胚胎周期拥有率35.89%。见表1。
2.2 低胚形成的囊胚冻融及移植后妊娠情况
220例冷冻周期目前解冻有低胚周期是54例78枚低胚培养的囊胚，其中复苏77枚移植77枚，复苏率为98.72%。移植了54例，其中18例获得临床妊娠，临床妊娠率约为33.33%，着床率约为23.38%。见表2。
2.3 囊胚形成情况与妊娠结局
, 百拇医药
低评分胚胎继续体外培养中有囊胚形成组的新鲜临床妊娠率为49.28%，无囊胚形成组的新鲜临床妊娠率为43.84%，两组间妊娠率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
3 讨论
目前在IVF—ET周期中，一般将第3天的优质胚胎进行移植或冷冻，剩余的低评分胚胎往往不被利用，但是仅仅凭第3天的胚胎形态学评分来衡量胚胎的发育潜能还无法做到足够科学和准确。胚胎形态学评分主要从胚胎的生长速率和碎片的多少来评价，胚胎的生长速率是评估胚胎潜在活力的有力指数，但生长缓慢的胚胎并非完全不具有正常妊娠的能力，有部分早期发育缓慢的胚胎在第3天以后的培养中赶上了生长的步伐，在临床上移植这样发育缓慢的低评分胚胎仍然获得妊娠并产下正常儿的例子屡见不鲜。同样，有碎片的胚胎不管修复与否，也能种植和产生足月分娩。这表明人类胚胎有高度的自我调节的能力，失去一半细胞仍然能够恢复，而且证实了成熟卵子包含有比胚胎发育需要更多的原料的普遍意见。并且，通过荧光原位杂交技术进行种植前卵裂球的基因诊断分析发现一个在总的形态学和基因正常状态之间令人奇怪的偏差，形态学最好的胚胎可能会有基因异常，而包含有碎片的评分质量一般的胚胎实际上有正常的种植潜力。本研究对613个周期中的2058个低评分胚胎进行体外继续培养，形成753个囊胚，其中冷冻了309个囊胚和13个致密桑葚胚，证明早期胚胎形态评分不能完全预测其发育潜力，体外继续培养可以进一步筛选出有发育潜能的低质量胚胎，提高胚胎利用率和累计妊娠率，最大限度节约胚胎。
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研究表明人类胚胎在8细胞期之前的生长仍然是由卵细胞本身的遗传物质控制的，因此早期卵裂不能体现胚胎自身的遗传物质(Braude et al，1988)。对胚胎质量或生长潜能的评估在胚胎基因活化之后进行应该更为合理，而桑椹胚和囊胚期的胚胎已经具备了活化的胚胎基因。文献报道，形成囊胚的胚胎其染色体异常比例更低。Balaban报道了158个周期的D3期Ⅲ—Ⅳ级分裂期胚胎，继续培养到D5胚胎发育至囊胚，进行移植并观察着床率，与162个周期的同样分级的分裂期胚胎D3期直接移植比较，着床率显著增高(15%比5.9%)，提示质量差的D3期胚胎也可以通过延长体外培养时间提高着床率，为质量较差的分裂期胚胎把握移植时机提出了一个新的思路。与分裂期胚胎移植比较，囊胚移植具有更符合人类生殖生理(胚胎于囊胚期进入宫腔环境)，选择的胚胎更准确，更具潜力，能减少移植数目，降低多胎风险，第5天子宫收缩明显减少，利于胚胎着床等优点，因此质量较差的卵裂期胚胎也可考虑D5移植。
有报道认为，体外受精治疗剩余胚胎的囊胚形成情况可以间接预测妊娠结局。梁菊艳等研究显示废弃胚胎继续培养有囊胚形成的患者临床妊娠率明显高于无囊胚形成的患者，提示胚胎有较好的发育潜能，可间接预测妊娠结局。本研究结果显示，废弃胚胎有囊胚形成的患者，其临床妊娠率略高于无囊胚形成的患者，提示其胚胎可能有较好的发育潜能，但两组间并无统计学差异。
本观察还发现，一些4细胞及4细胞以下的Ⅲ—Ⅳ级胚胎，尽管含碎片较多，仍然可以形成可利用的囊胚，这种情况的出现，可能是观察的不准确造成的，目前对卵裂期的胚胎评分仅仅采用形态学的判断标准，对其中的“碎片”的评判无法做得完全客观正确，缺乏科学依据。有文献报道，对于D3的卵裂期胚胎，胚胎内直径小于40的“细胞”内通常不含遗传物质，但实际上仍有一定比例的遗传物质，也是真正的细胞。因此，为了避免这类形态学评分局限的误差，更应该将形态学评分低的胚胎进行囊胚培养，进一步筛选出优质胚胎。, 百拇医药(刘英 黄雅丹等)