Tca8113肿瘤微环境诱导小鼠髓源性树突状细胞免疫耐受性的研究(2)
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参见附件。
1.4.3 树突状细胞培养
将收集到的小鼠骨髓细胞以含10μg/ml rmGM-CSF+10μg/ml rmIL-4的10%胎牛血清RPMI1640培养液配成2×109/L骨髓细胞悬液，6ml/瓶接种于50ml培养瓶。将其分为实验组(tca8113-DC)：培养体系中再加入含 cs-Tca8113 1.4ml；对照组(DC)：不加任何干预因素。所有细胞置37℃、5%CO2，饱和湿度条件下培养48h换液，仅保留贴壁细胞，同时再加入培养液实验组加入含培养液6ml；实验组再加入1.4mlcs-tca8113；之后隔日半量换液，实验组额外补入3ml培养液+0.7ml cs-Tca8113；培养至第六天收集悬浮细胞计。每组取1/3细胞送流式细胞仪检测，每组剩余2/3细胞10%胎牛血清RPMI1640 4ml重悬后接种于20ml培养瓶，同时加入LPS至10μg/ml，继续所有细胞置37℃、5%CO2，饱和湿度条件下培养24小时后，收集各组悬浮细胞(LPS+DC、LPS+tca8113-DC)，送流式细胞仪检测及混合淋巴细胞反应。
1.4.4 DCs表型CD11c、CD86、MCH-Ⅱ检测
于培养第六天收集各组悬浮细胞部分送流式细胞仪检测，部分细胞加入LPS培养24小时后送流式细胞仪检测
1.4.5 混合淋巴细胞反应
制备C57BL/6小鼠脾细胞悬液，用淋巴细胞分层液李显获得单核细胞，尼龙毛刷吸附获得T淋巴细胞，与经50微克/ml丝裂霉素C灭活的各组DC(2×105/孔)以不同浓度梯度混合培养与96孔原地细胞培养板中(含10%胎牛血清RPMI 1640培养液)，并设置阴性对照和无细胞空白对照，混合培养48h后在待测空中加入MTT液(5mg/ml)，4h后吸去培养液和MTT混合液 ......
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