谈对中药的抑菌作用的分析
【中图分类号】R9 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783(2011)06-0348-01
【摘要】由真菌引起的病害防治困难，只要有部分真菌细胞不被杀死，在适宜条件下就能生长繁殖，因此本抗菌实验以真菌生长完全受到抑制来评价抑菌效果,即在较长时间(14 d)仍能保持对真菌生长的抑制，才是理想的抗菌药物。目的：筛选抗龙胆叶枯病菌活性的中药。方法：以龙胆叶枯病菌(Alternaria sp.)为供试菌种，对9种中药乙醇提取物进行抗龙胆叶枯病菌活性实验，采用有限稀释法，测定最低抑菌浓度。结果：9种中药乙醇提取物均有抑菌作用，其中蛇床子、川楝子提取物14 d的最低抑菌浓度MIC100小于0.1 g/ml。结论蛇床子、川楝子具有较强的抗龙胆叶枯病菌作用，可进一步开发为防治龙胆叶枯病药物。
【主题词】中药 杀菌剂 抑菌 作用 分析
龙胆叶枯病(Alternaria sp.)是龙胆生产中的重要叶部病害，发生普遍。在龙胆及其它药材生产中对病害的防治大量使用化学药剂，导致环境污染、农药残留，影响药材的质量。我国中药资源丰富，许多中药含抑菌活性物质，从中寻找抑制植物病原菌活性物质，研制植物源新型杀菌剂，防治药用植物病害，对生产符合GAP标准中药材具有重要意义。
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目前，国内外学者在中草药抗真菌实验方面已做了大量的工作 ，而从中筛选抗药用植物病原真菌的研究较少。本研究根据以往中药抗真菌文献报道，选出9种中药，研究其对龙胆叶枯病菌(Alternaria sp.)的抑制作用。
一 材料与方法
1. 材料：1)中药：地肤子、苦参 、知母、川楝子、蛇床子、大风子、苍耳子、白鲜皮、土槿皮购于哈尔滨市同泰大药房，经鉴定为正品；95%乙醇(天津泰达化工有限公司)，葡萄糖(沈阳市试剂三厂)，琼脂(青岛水产品加工厂)。
2) 供试菌种：龙胆叶枯病菌,从黑龙江北安栽培的粗糙龙胆Gentiana scabra Bunge中分离纯化得到，采用从病组织分离培养，将分离得到的菌种接种到PDA培养基上培养，待产生孢子后，采用单孢分离的方法对菌种进行纯化。应用柯赫氏证病法则(Kochˊs postulate)证明为龙胆叶枯病病菌，通过对分生孢子梗、分生孢子等的观察鉴定为Alternaria sp.。
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3)培养基：用PDA培养基。
2 方法
1)样品的制备：将中药样品于60℃烘干，经粉碎过20目筛，加5倍量的95%乙醇回流提取两次，2 h/次，滤过，滤液减压浓缩至1 g/ml(即每毫升含1 g生药)。浓缩液于冰箱(0～4℃)冷藏备用。
2) 菌种活化：将保存的菌种接于PDA培养基上培养4d备用。
3) 抑菌实验：在无菌操作条件下，以1 g/ml生药的药液为原液，用灭菌PDA培养基稀释，分别 稀释为原液的50% ，40% ，30% ，20%，10% ，5%，1% ，0.8%，0.6%，0.4%，0.2%，0.1%(相当于每毫升含0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0.05，0.01，0.008，0.006，0.004，0.002，0.001 g生药)12个浓度的药基，对照为70%乙醇代替药液配制，并控制药基中的乙醇含量在15%以下(在配制高浓度的药基前，对加入的药液挥去部分乙醇)，每管接种新培养的真菌菌落边缘2 mm2的真菌菌丝块，重复3次，25℃培养。每天观察接种菌落生长情况，凡生长的菌落记为“+”，凡完全不生长的菌落记为“-”。
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4) MIC100的确定：MIC100为杀真菌剂(fungicide)的最低抑菌浓度，菌种接种在每种药物系列梯度浓度培养基上，恒温箱中培养7 d 和14 d，用肉眼观察，接种菌块未扩大，无细胞生长，取完全不生长管最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。
二 结果
抗菌实验结果： 9种中药乙醇提取物对龙胆叶枯病菌(Alternaria sp.)的抑制作用(略)各中药乙醇提取物的最低抑菌浓度，结果 中药乙醇提取物对龙胆叶枯病菌(略)
研究表明，9种中药乙醇提取物对龙胆叶枯病病菌(Alternaria sp.)均有不同程度的抑制作用，随着培养时间的延长，抑菌作用逐渐减弱，培养7 d最低抑菌浓度MIC100≤0.2 g/ml有地肤子、蛇床子、白鲜皮、川楝子、大风子，最低抑菌浓度MIC100≤0.1 g/ml有蛇床子、白鲜皮、川楝子；培养14 d最低抑菌浓度≤0.2 g/ml有川楝子、蛇床子、大风子，培养14 d 最低抑菌浓度MIC100为0.1 g/ml有川楝子、蛇床子。将药基上的菌种转接到无药PDA培养基上仍不能生长，表明真菌已被杀死，川楝子、蛇床子乙醇提取物有较强抗龙胆叶枯病菌(Alternaria sp.)作用，其次为白鲜皮和大风子，可进一步作田间实验。
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三 讨论
用乙醇提取抗菌活性物质优于水提法。本实验采用乙醇回流提取法，有利于生物碱等生物活性物质的提取，同时减少了提取液中蛋白质、多糖等杂质。
本实验采用在药基上接种菌丝体的方法测定药物抗真菌活性，属于固体琼脂筛选抗真菌药物，并采用有限稀释法测定MIC100，该法操作简便。前人实验多采用培养基与药物同时灭菌的方法，本实验在药基配制时，仅对培养基进行高温灭菌，冷却至70℃左右用微量移液器加入药物，药物有效成分不被破坏，在经长时间培养未滋生杂菌，实验方法可靠。
由真菌引起的病害防治困难，只要有部分真菌细胞不被杀死，在适宜条件下就能生长繁殖，因此本抗菌实验以真菌生长完全受到抑制来评价抑菌效果,即在较长时间(14 d)仍能保持对真菌生长的抑制，才是理想的抗菌药物。9种中药经长时间抑菌试验观察，川楝子、蛇床子乙醇提取物对龙胆叶枯病菌抑菌作用强而持久，是理想的抗龙胆叶枯病真菌的中药。白鲜皮在培养7 d时抑菌作用最强，虽然到14 d时抑菌作用有所下降，也是一个较理想的抗真菌药物。有待对其抗菌机理进一步研究。
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参考文献
[1] 冯俊涛,石勇强,张兴.56种植物抑菌活性筛选试验[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2001,29(2):65.
[2] 王理达，胡迎庆，屠鹏飞，等.13种生药提取物及化学成分的抗真菌活性筛选[J].中草药,2001,32(3):241.
[3] 曹仁烈，孙在原.中药水浸剂在试管内抗皮肤真菌的观察[J].中华皮肤科杂志,1957,4：286.
[4] 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2002：1711.
[5] 高微微，李 展，林文卫.中药提取物的抑菌试验[J].中国饲料,1999,12：12
[6] 方中达. 植病研究方法[M].北京：农业出版社,1987：83，150.
[7] 马廉兰,钟有添.6种中草药对深部感染真菌的体外抑菌效果[J]. 赣南医学院学报, 2001,21(1):1.
作者单位：150008 哈药集团医药有限公司, http://www.100md.com(姜红 任丹丹)
【摘要】由真菌引起的病害防治困难，只要有部分真菌细胞不被杀死，在适宜条件下就能生长繁殖，因此本抗菌实验以真菌生长完全受到抑制来评价抑菌效果,即在较长时间(14 d)仍能保持对真菌生长的抑制，才是理想的抗菌药物。目的：筛选抗龙胆叶枯病菌活性的中药。方法：以龙胆叶枯病菌(Alternaria sp.)为供试菌种，对9种中药乙醇提取物进行抗龙胆叶枯病菌活性实验，采用有限稀释法，测定最低抑菌浓度。结果：9种中药乙醇提取物均有抑菌作用，其中蛇床子、川楝子提取物14 d的最低抑菌浓度MIC100小于0.1 g/ml。结论蛇床子、川楝子具有较强的抗龙胆叶枯病菌作用，可进一步开发为防治龙胆叶枯病药物。
【主题词】中药 杀菌剂 抑菌 作用 分析
龙胆叶枯病(Alternaria sp.)是龙胆生产中的重要叶部病害，发生普遍。在龙胆及其它药材生产中对病害的防治大量使用化学药剂，导致环境污染、农药残留，影响药材的质量。我国中药资源丰富，许多中药含抑菌活性物质，从中寻找抑制植物病原菌活性物质，研制植物源新型杀菌剂，防治药用植物病害，对生产符合GAP标准中药材具有重要意义。
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目前，国内外学者在中草药抗真菌实验方面已做了大量的工作 ，而从中筛选抗药用植物病原真菌的研究较少。本研究根据以往中药抗真菌文献报道，选出9种中药，研究其对龙胆叶枯病菌(Alternaria sp.)的抑制作用。
一 材料与方法
1. 材料：1)中药：地肤子、苦参 、知母、川楝子、蛇床子、大风子、苍耳子、白鲜皮、土槿皮购于哈尔滨市同泰大药房，经鉴定为正品；95%乙醇(天津泰达化工有限公司)，葡萄糖(沈阳市试剂三厂)，琼脂(青岛水产品加工厂)。
2) 供试菌种：龙胆叶枯病菌,从黑龙江北安栽培的粗糙龙胆Gentiana scabra Bunge中分离纯化得到，采用从病组织分离培养，将分离得到的菌种接种到PDA培养基上培养，待产生孢子后，采用单孢分离的方法对菌种进行纯化。应用柯赫氏证病法则(Kochˊs postulate)证明为龙胆叶枯病病菌，通过对分生孢子梗、分生孢子等的观察鉴定为Alternaria sp.。
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3)培养基：用PDA培养基。
2 方法
1)样品的制备：将中药样品于60℃烘干，经粉碎过20目筛，加5倍量的95%乙醇回流提取两次，2 h/次，滤过，滤液减压浓缩至1 g/ml(即每毫升含1 g生药)。浓缩液于冰箱(0～4℃)冷藏备用。
2) 菌种活化：将保存的菌种接于PDA培养基上培养4d备用。
3) 抑菌实验：在无菌操作条件下，以1 g/ml生药的药液为原液，用灭菌PDA培养基稀释，分别 稀释为原液的50% ，40% ，30% ，20%，10% ，5%，1% ，0.8%，0.6%，0.4%，0.2%，0.1%(相当于每毫升含0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0.05，0.01，0.008，0.006，0.004，0.002，0.001 g生药)12个浓度的药基，对照为70%乙醇代替药液配制，并控制药基中的乙醇含量在15%以下(在配制高浓度的药基前，对加入的药液挥去部分乙醇)，每管接种新培养的真菌菌落边缘2 mm2的真菌菌丝块，重复3次，25℃培养。每天观察接种菌落生长情况，凡生长的菌落记为“+”，凡完全不生长的菌落记为“-”。
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4) MIC100的确定：MIC100为杀真菌剂(fungicide)的最低抑菌浓度，菌种接种在每种药物系列梯度浓度培养基上，恒温箱中培养7 d 和14 d，用肉眼观察，接种菌块未扩大，无细胞生长，取完全不生长管最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。
二 结果
抗菌实验结果： 9种中药乙醇提取物对龙胆叶枯病菌(Alternaria sp.)的抑制作用(略)各中药乙醇提取物的最低抑菌浓度，结果 中药乙醇提取物对龙胆叶枯病菌(略)
研究表明，9种中药乙醇提取物对龙胆叶枯病病菌(Alternaria sp.)均有不同程度的抑制作用，随着培养时间的延长，抑菌作用逐渐减弱，培养7 d最低抑菌浓度MIC100≤0.2 g/ml有地肤子、蛇床子、白鲜皮、川楝子、大风子，最低抑菌浓度MIC100≤0.1 g/ml有蛇床子、白鲜皮、川楝子；培养14 d最低抑菌浓度≤0.2 g/ml有川楝子、蛇床子、大风子，培养14 d 最低抑菌浓度MIC100为0.1 g/ml有川楝子、蛇床子。将药基上的菌种转接到无药PDA培养基上仍不能生长，表明真菌已被杀死，川楝子、蛇床子乙醇提取物有较强抗龙胆叶枯病菌(Alternaria sp.)作用，其次为白鲜皮和大风子，可进一步作田间实验。
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三 讨论
用乙醇提取抗菌活性物质优于水提法。本实验采用乙醇回流提取法，有利于生物碱等生物活性物质的提取，同时减少了提取液中蛋白质、多糖等杂质。
本实验采用在药基上接种菌丝体的方法测定药物抗真菌活性，属于固体琼脂筛选抗真菌药物，并采用有限稀释法测定MIC100，该法操作简便。前人实验多采用培养基与药物同时灭菌的方法，本实验在药基配制时，仅对培养基进行高温灭菌，冷却至70℃左右用微量移液器加入药物，药物有效成分不被破坏，在经长时间培养未滋生杂菌，实验方法可靠。
由真菌引起的病害防治困难，只要有部分真菌细胞不被杀死，在适宜条件下就能生长繁殖，因此本抗菌实验以真菌生长完全受到抑制来评价抑菌效果,即在较长时间(14 d)仍能保持对真菌生长的抑制，才是理想的抗菌药物。9种中药经长时间抑菌试验观察，川楝子、蛇床子乙醇提取物对龙胆叶枯病菌抑菌作用强而持久，是理想的抗龙胆叶枯病真菌的中药。白鲜皮在培养7 d时抑菌作用最强，虽然到14 d时抑菌作用有所下降，也是一个较理想的抗真菌药物。有待对其抗菌机理进一步研究。
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参考文献
[1] 冯俊涛,石勇强,张兴.56种植物抑菌活性筛选试验[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2001,29(2):65.
[2] 王理达，胡迎庆，屠鹏飞，等.13种生药提取物及化学成分的抗真菌活性筛选[J].中草药,2001,32(3):241.
[3] 曹仁烈，孙在原.中药水浸剂在试管内抗皮肤真菌的观察[J].中华皮肤科杂志,1957,4：286.
[4] 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2002：1711.
[5] 高微微，李 展，林文卫.中药提取物的抑菌试验[J].中国饲料,1999,12：12
[6] 方中达. 植病研究方法[M].北京：农业出版社,1987：83，150.
[7] 马廉兰,钟有添.6种中草药对深部感染真菌的体外抑菌效果[J]. 赣南医学院学报, 2001,21(1):1.
作者单位：150008 哈药集团医药有限公司, http://www.100md.com(姜红 任丹丹)