加热法破坏IgM在孕妇免疫血清学检测中的应用(1)
【摘 要】目的：探讨不同方法破坏IgM，检测孕妇IgG抗A(B)抗体效价的效果。方法：随机检测7例门诊O型Rh阳性孕妇，对每一例孕妇血清分成三份，分别采用63℃10分钟、63℃20分钟及DTT破坏血清IgM后，比较IgG抗A(B)效价的差异，并探讨63℃10分钟、63℃20分钟及DTT法的相关性。结果：水浴法不仅中和IgM抗体，。63℃20分钟与DTT法比较IgG抗A(B)效价结果存在显著差别(P<0. 05)，63℃10分钟与DTT法比较IgG抗A(B)效价结果无显著差别(P>0. 05)。三种方法分离IgG结果有高度正相关。结论：63℃加热10分钟操作简单，影响因素少，没有致癌性，对身体影响小，试验时间也较DTT短，是值得运用的技术。
【关键词】孕妇免疫性抗体;水浴加热法;DTT
【中图分类号】 R715
【文献标识码】 B 【文章编号】 1672-3783(2019)04-03-010-01
背景
新生儿溶血病(HDN)是发生在胎儿或新生儿的一种免疫溶血性疾病，是由母婴血型不合引起。研究证实[12]，母亲的IgG可通过胎盘上的Fc受体转运到胎儿体内。新生儿溶血病的发病几率依照孕妇IgG抗A或者抗B的抗体效价而变化，效价越高，发病几率越大，且孕妇抗体效价变化越快越早，新生儿溶血病的发病几率越大[3]血清中抗A和抗B是IgM和IgG的混合物，要测定IgG抗A和抗B抗体，需要排除IgM的干扰。然而采用二硫苏糖醇(DTT)方法破坏gM抗体是血型血清学检查中的常用技术，这种方法所需时间长，很难及时为临床提供诊断依据，国内有人报道血型血清加入生理鹽水70℃水浴30分钟破坏gM抗体完全且不影响IgG[4]，外国文献指出63度10分钟的温度能破坏IgM抗体[5]. 为了提高血清学检查的效率，探讨新方法来补充临床实验室对检测孕妇免疫性抗体。运用63℃10分钟和63℃20分钟水浴法对7例标本对比中和IgM的效果，及平行测定IgG抗A(B)效价与DTT测定结果进行比较，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 标本来源
随机选取7例O型孕妇，Rh (D)阳性，不完全抗体筛选试验阴性为对象，。
1.2 仪器与试剂
可调节温度水浴箱、恒温水浴箱、;3% A型和B型Rh(D)阳性血球(选6～8人份配制)、0.8% 标准A、B型血球(长春博讯生物技术公司，)10mmol/lDTT(BIOSHARP公司)抗人球蛋白(抗IgG+C3d)检测卡(江苏力博生物技术公司)，LB-3000医用低速离心机等。
1.3 操作与方法
1.3.1 将7例O型孕妇血清分成2份，一份用两种方法检测IgM 抗A(B)效价。①DTT检测法：取孕妇血清100ul与10mol/LDTT溶液700ul混匀，加盖37℃孵育30分钟，0.9%氯化钠溶液作倍比稀释，稀释度分别为1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，1：512等。然后加入3%A，B型红细胞悬液各一滴，直接3000转15秒离心肉眼观察试管是否凝集。以出现凝集强度1+的最高稀释度的倒数为孕妇IgM抗A(B)效价②水浴检测法：调节水浴箱温度到63度，做2管标记，1管取100ul血清加入300ul生理盐水混匀，放63度水浴箱10分钟。另一管取100ul血清加入300ul生理盐水混匀，放63度水浴箱20分钟.后续各管用0.9%氯化钠溶液倍比稀释，稀释度分别为1：8，1：16等。然后加入3%A，B型红细胞悬液各一滴，直接3000转15秒离心肉眼观察试管是否凝集。以出现凝集强度1+的最高稀释度的倒数为孕妇IgG 抗A(B)效价
1.3.2 另一份用三种方法检测IgG 抗A(B)效价。①DTT检测法：取孕妇血清100ul与10mol/LDTT溶液700ul混匀 ，加盖37℃孵育30分钟，0.9%氯化钠溶液作倍比稀释，稀释度分别为1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，1：512等。然后吸取25μl稀释处理好的血清，加入中抗人球蛋白(抗IgG+C3d)检测卡，再加入其标准0.8%A，B红细胞各1滴，混匀37℃孵育15min，用LB-3000离心机离心9min，结果判读。②水浴检测法：调节水浴箱温度到63度，做2管标记，1管取100ul血清加入300ul生理盐水混匀，放63度水浴箱10分钟。另一管取100ul血清加入300ul生理盐水混匀，放63度水浴箱20分钟。后续各管用0.9%氯化钠溶液倍比稀释，然后吸取25ul稀释处理好的血清，加入中抗人球蛋白(抗IgG+C3d)检测卡，再加入其0.8%标准A，B红细胞，混匀37℃孵育15min，用LB-3000离心机离心9min，结果判读
1.4 统计学处理 用Graphpad prism6统计软件，检测结果以2 为底数取指数后计算结果。P<0.05表示两组之间有显著性差异。用pearson检验做相关性分析，若P<0.05表示两组之间有显著性相关。
2 结果
2.1 三种方法中和IgM抗体结果
DTT法和63℃水浴法对IgM抗体中和效果无明显差异，63℃10min与63℃20 min破坏IgM抗体同样较彻底。遂接下来选择63℃10分钟和63℃20分钟水浴法对IgG抗体进行检测。见表1.
2.2 三种方法取得IgG效价
分别用63℃10min与63℃20min检测7例0型孕妇IgG效价，对检测结果DTT30min进行医学统计，方差齐(P<0.01)，用单向方差分析检验，63℃10min与DTT30min检测效果无显著性差异(P>0.05)，63℃20min与DTT30min检测效果有显著性差异(P<0.05)，63℃10min检测检测IgG抗A(B)效价结果同样也准确。见表2, http://www.100md.com(楼菊蓉)
【关键词】孕妇免疫性抗体;水浴加热法;DTT
【中图分类号】 R715
【文献标识码】 B 【文章编号】 1672-3783(2019)04-03-010-01
背景
新生儿溶血病(HDN)是发生在胎儿或新生儿的一种免疫溶血性疾病，是由母婴血型不合引起。研究证实[12]，母亲的IgG可通过胎盘上的Fc受体转运到胎儿体内。新生儿溶血病的发病几率依照孕妇IgG抗A或者抗B的抗体效价而变化，效价越高，发病几率越大，且孕妇抗体效价变化越快越早，新生儿溶血病的发病几率越大[3]血清中抗A和抗B是IgM和IgG的混合物，要测定IgG抗A和抗B抗体，需要排除IgM的干扰。然而采用二硫苏糖醇(DTT)方法破坏gM抗体是血型血清学检查中的常用技术，这种方法所需时间长，很难及时为临床提供诊断依据，国内有人报道血型血清加入生理鹽水70℃水浴30分钟破坏gM抗体完全且不影响IgG[4]，外国文献指出63度10分钟的温度能破坏IgM抗体[5]. 为了提高血清学检查的效率，探讨新方法来补充临床实验室对检测孕妇免疫性抗体。运用63℃10分钟和63℃20分钟水浴法对7例标本对比中和IgM的效果，及平行测定IgG抗A(B)效价与DTT测定结果进行比较，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 标本来源
随机选取7例O型孕妇，Rh (D)阳性，不完全抗体筛选试验阴性为对象，。
1.2 仪器与试剂
可调节温度水浴箱、恒温水浴箱、;3% A型和B型Rh(D)阳性血球(选6～8人份配制)、0.8% 标准A、B型血球(长春博讯生物技术公司，)10mmol/lDTT(BIOSHARP公司)抗人球蛋白(抗IgG+C3d)检测卡(江苏力博生物技术公司)，LB-3000医用低速离心机等。
1.3 操作与方法
1.3.1 将7例O型孕妇血清分成2份，一份用两种方法检测IgM 抗A(B)效价。①DTT检测法：取孕妇血清100ul与10mol/LDTT溶液700ul混匀，加盖37℃孵育30分钟，0.9%氯化钠溶液作倍比稀释，稀释度分别为1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，1：512等。然后加入3%A，B型红细胞悬液各一滴，直接3000转15秒离心肉眼观察试管是否凝集。以出现凝集强度1+的最高稀释度的倒数为孕妇IgM抗A(B)效价②水浴检测法：调节水浴箱温度到63度，做2管标记，1管取100ul血清加入300ul生理盐水混匀，放63度水浴箱10分钟。另一管取100ul血清加入300ul生理盐水混匀，放63度水浴箱20分钟.后续各管用0.9%氯化钠溶液倍比稀释，稀释度分别为1：8，1：16等。然后加入3%A，B型红细胞悬液各一滴，直接3000转15秒离心肉眼观察试管是否凝集。以出现凝集强度1+的最高稀释度的倒数为孕妇IgG 抗A(B)效价
1.3.2 另一份用三种方法检测IgG 抗A(B)效价。①DTT检测法：取孕妇血清100ul与10mol/LDTT溶液700ul混匀 ，加盖37℃孵育30分钟，0.9%氯化钠溶液作倍比稀释，稀释度分别为1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，1：512等。然后吸取25μl稀释处理好的血清，加入中抗人球蛋白(抗IgG+C3d)检测卡，再加入其标准0.8%A，B红细胞各1滴，混匀37℃孵育15min，用LB-3000离心机离心9min，结果判读。②水浴检测法：调节水浴箱温度到63度，做2管标记，1管取100ul血清加入300ul生理盐水混匀，放63度水浴箱10分钟。另一管取100ul血清加入300ul生理盐水混匀，放63度水浴箱20分钟。后续各管用0.9%氯化钠溶液倍比稀释，然后吸取25ul稀释处理好的血清，加入中抗人球蛋白(抗IgG+C3d)检测卡，再加入其0.8%标准A，B红细胞，混匀37℃孵育15min，用LB-3000离心机离心9min，结果判读
1.4 统计学处理 用Graphpad prism6统计软件，检测结果以2 为底数取指数后计算结果。P<0.05表示两组之间有显著性差异。用pearson检验做相关性分析，若P<0.05表示两组之间有显著性相关。
2 结果
2.1 三种方法中和IgM抗体结果
DTT法和63℃水浴法对IgM抗体中和效果无明显差异，63℃10min与63℃20 min破坏IgM抗体同样较彻底。遂接下来选择63℃10分钟和63℃20分钟水浴法对IgG抗体进行检测。见表1.
2.2 三种方法取得IgG效价
分别用63℃10min与63℃20min检测7例0型孕妇IgG效价，对检测结果DTT30min进行医学统计，方差齐(P<0.01)，用单向方差分析检验，63℃10min与DTT30min检测效果无显著性差异(P>0.05)，63℃20min与DTT30min检测效果有显著性差异(P<0.05)，63℃10min检测检测IgG抗A(B)效价结果同样也准确。见表2, http://www.100md.com(楼菊蓉)