临床检验中PCR技术的应用
【中图分类号】R446.33【文献标识码】A【文章编号】1672-3783(2012)10-0134-01
医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应(PCR)技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。一般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对DNA纯化有限，但适应临床微量、快速的特点。另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。
PCR检测的临床应用范围：用于疾病的早期诊断，疾病的鉴别诊断，疾病的病因确定，药物疗效的评价，治疗效果的评价，治愈标准的确定。
通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。PCR法检测乙肝的优势表现在：
①早期诊断，因为PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。
②对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用PCR法检出。
③疗效跟踪及病程判断，因为PCR能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的浓度很低，丙肝病毒的分离尚未成功。目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于HCV尚无法分离纯化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，这些人工抗原与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性或假阴性。同时血清中抗体的出现及动态变化与病人病情无线性相关关系。RT-PCR技术使这些困难得到解决。HCV是RNA病毒，需先将病毒RNA逆转录为cDNA(RT)后再进行PCR扩增，这种技术称之为逆转录-PCR(RT-PCR)。
PCR检测在性传播性疾病(STD)的诊断中有较广泛的应用。经典的性传播疾病有梅毒、淋病、腹股沟淋巴肉芽肿、软锐湿疠、硬下疳等。而在现代STD中、解尿支原体及沙眼衣原体引起的非淋菌性尿道炎(NGU)可能更具有代表性意义。检测标本无特殊限制： 痰、尿、腹水、胸水、关节液、血、肺泡灌洗液、脑脊液、分泌物等均可送检PCR检测淋球菌。淋病的临床表现缺乏特异性，其确诊主要是进行实验室检查。传统的方法有涂片染色法，分离培养法和用来检测淋球菌抗原的EIA-Gonozyme系统法。近年来，荧光定量PCR诊断技术的应用，使淋病的快速诊断有重大突破。
循环系统以肠道小RNA病毒感染最具代表意义，如柯萨奇病毒等。这些病毒经肠道粘膜、淋巴结进入血液，最终可定位于心肌细胞中导致心肌炎。目前对这些病毒的血液样本检测往往比较困难。PCR用于柯萨奇病毒检测时因其是RNA病毒所以应注意样本的保存。外在环境中存在大量RNA酶，病毒脱壳后RNA将被迅速降解。一般用于RNA检测的血清常温下不应超过24小时，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。
PCR敏感性高可以检测出血清中低浓度的病毒，了解病毒在体内复制的动态状况。
参考文献
[1]《中国医学检验杂志》.2001，11：13-14
[2]姜怀春.pcr技术研究新进展.重庆工商大学报，2005.22(4)：232-235, 百拇医药(杨军)
医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应(PCR)技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。一般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对DNA纯化有限，但适应临床微量、快速的特点。另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。
PCR检测的临床应用范围：用于疾病的早期诊断，疾病的鉴别诊断，疾病的病因确定，药物疗效的评价，治疗效果的评价，治愈标准的确定。
通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。PCR法检测乙肝的优势表现在：
①早期诊断，因为PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。
②对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用PCR法检出。
③疗效跟踪及病程判断，因为PCR能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的浓度很低，丙肝病毒的分离尚未成功。目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于HCV尚无法分离纯化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，这些人工抗原与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性或假阴性。同时血清中抗体的出现及动态变化与病人病情无线性相关关系。RT-PCR技术使这些困难得到解决。HCV是RNA病毒，需先将病毒RNA逆转录为cDNA(RT)后再进行PCR扩增，这种技术称之为逆转录-PCR(RT-PCR)。
PCR检测在性传播性疾病(STD)的诊断中有较广泛的应用。经典的性传播疾病有梅毒、淋病、腹股沟淋巴肉芽肿、软锐湿疠、硬下疳等。而在现代STD中、解尿支原体及沙眼衣原体引起的非淋菌性尿道炎(NGU)可能更具有代表性意义。检测标本无特殊限制： 痰、尿、腹水、胸水、关节液、血、肺泡灌洗液、脑脊液、分泌物等均可送检PCR检测淋球菌。淋病的临床表现缺乏特异性，其确诊主要是进行实验室检查。传统的方法有涂片染色法，分离培养法和用来检测淋球菌抗原的EIA-Gonozyme系统法。近年来，荧光定量PCR诊断技术的应用，使淋病的快速诊断有重大突破。
循环系统以肠道小RNA病毒感染最具代表意义，如柯萨奇病毒等。这些病毒经肠道粘膜、淋巴结进入血液，最终可定位于心肌细胞中导致心肌炎。目前对这些病毒的血液样本检测往往比较困难。PCR用于柯萨奇病毒检测时因其是RNA病毒所以应注意样本的保存。外在环境中存在大量RNA酶，病毒脱壳后RNA将被迅速降解。一般用于RNA检测的血清常温下不应超过24小时，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。
PCR敏感性高可以检测出血清中低浓度的病毒，了解病毒在体内复制的动态状况。
参考文献
[1]《中国医学检验杂志》.2001，11：13-14
[2]姜怀春.pcr技术研究新进展.重庆工商大学报，2005.22(4)：232-235, 百拇医药(杨军)