前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因与冠心病
冠心病是严重危害人类健康的疾病之一。近年来一些大规模前瞻性研究如弗明汉(framingham)研究、多种危险因素干预研究(MRFIT)和明斯特心脏研究(PRO-CAM)发现：冠心病发生很少取决于单一因素，多取决于两个或两个以上的危险因素的协同作用，也就是说，冠心病是一种由多种遗传或环境因素共同作用所致的复杂的多基因疾病。血脂水平是动脉粥样硬化和冠心病发病因素中最重要的危险因素之一。血脂异常具有复杂的病因机制，为多个基因之间或多个基因与环境因素之间相互作用的结果。近年来，随着对高胆固醇血症研究的不断深入，继低密度脂蛋白受体基因(LDLR)和载脂蛋白B-100(apoB-100)基因后，发现一种新的相关基因，即前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因。目前PCSK9已成为高胆固醇血症研究的一个热点。本文就该基因的结构、功能及其与脂质代谢及冠心病的关系作一简要介绍。
1 PCSK9简介
人类PCSK9基因定位于染色体lp32.3，长约22 kh，由信号肽、前结构域、催化结构域和羧基末端结构域(V结构域)顺次连接而成，所编码酸性糖蛋白各区域氨基酸序号分别为1～30、31～152、153～452、453～692。PCSK9蛋白合成分泌与其他前蛋白转化酶相似，内质网中合成PCSK9酶原(apo—PCSK9，74 kD)，apo—PCSK9于内质网或高尔基体中发生自身催化反应，在SVFAQ152处裂解释放前肽(14 kD)形成成熟蛋白酶(60 kD)并分泌人血。PCSK9主要在肝脏、肠道表达，在肾脏、皮肤、脑中只有少量表达。
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2 PCSK9与高脂血症
2.1 PCSK9与脂质代谢 脂类的内平衡受到固醇调节元件结合蛋白(sREBP)-la，-lb，和-2三种DNA结合蛋白的转录调控。SREBP属于螺旋一环一螺旋亮氨酸拉链转录因子家族，其主要功能是激活参与胆固醇和脂肪酸生物合成和代谢及LDLR合成的基因。研究发现，过度表达SREBP—la或SREBP-2的转活结构域的转基因小鼠有明显pcsk9的表达上调。细胞内低胆固醇或他汀药处理培养的肝细胞若胆固醇缺失，均可激活SREBPla、SREBP2.而SREBPI a和SREBP2过表达可上调pcsk9表达。在SREBP的转基因鼠中，pcsk9表达被明显抑制，证明pcsk9有可能是SREBP的靶基因。LDLR与体内低密度脂蛋白(LDL)的代谢密切相关，通过介导细胞摄取LDL，增加LDL的降解，对于血浆LDL维持于一相对恒定水平具有重要作用。LD.LR基因也是受SREBP-2调控的。研究表明，肝脏胆固醇的缺失可以激活SREBPs诱导pcsk9的表达增加从而调控LDLR水平。SREBP就是通过与LDLR的SRE结合来调控LDLR的转录，从而维持细胞内外LDL的平衡。将人pcsk9基因导入培养的细胞，并未见LDLR mRNA水平改变.但LDLR蛋白表达却显著减少，且细胞对荧光标记的LDL内吞功能显著降低。上述研究表明，pcsk9基因表达产物NARC—1降低细胞表面LDLR蛋白并干扰LDLR介导的细胞对胆固醇的摄取，但有研究者认为pcsk9基因可能不是通过传统的固醇调节元件介导的转录途径调节LDLR表达，而是通过新的机制调节LDLR功能。
, 百拇医药
2.2 PCSK9基因多态性与高胆固醇血症Cunningham等研究发现，D374Y突变与FH和早发心血管疾病相关。突变型PCSK9在中性环境中与受体的结合力比野生型强25倍，而在酸性环境中则形成高亲和力的络合物。因此推断PCSK9可能通过直接结合而不一定是水解LDLR的机制减少细胞表面LDLR。Chen等t13 J发现.PCSK9的E670G(23968A>c)与血清LDL—C水平相关，GG型LDL—c水平最高，AG型LDL—c水平居中，AA型LDL—c水平最低。Camemn等发现了4个PCSK9功能缺失突变(R46L、G106R、N157K、R237W)与细胞表面LDLR表达和LDL内吞密切相关；而2个PCSIO增益突变(S127R和D374R)亦与细胞表面LDLR表达和LDL内吞有密切的关系。所谓功能增益型突变是指通过增加PCSK9的功能、降低LDLR的表达而升高血清胆固醇。Hallman等对478名非洲裔美国人和1086名白人研究发现.非洲裔美国人中X142和X679等位基因携带者比非携带者LDL—c水平低，白人中IA6等位基因携带者比非携带者LDL—c水平明显降低。Hooper等对653名非洲黑人女性研究发现.PCSK9基因C679X无义突变存在于3.7%的津巴布韦黑人中，该突变可引起LDL—c降低，但对HDL—c无影响。Co-hen等的研究也得到相似的结论。Yue等对403名高加索人的研究发现，PCSK9的c43 44插入CTG突变在高加索人中与血清LDL2C水平存在相关性，该突变在3个非洲裔美国人和高加索人家族性低B2脂蛋白血症家族中亦有发现，44插入CTG在高加索人中起降胆固醇的作用。Evance对506例血脂异常患者研究发现，PCSK9基因的E607G突变在男性中与LDL—c升高有相关性，而在女性中则无相关性。Chen等发现，PCSK9基因的E670G及23968A>G突变中G等位基因单倍体与高水平的LDL—c有相关性，但Kotowski等,发现该突变在德克萨斯人中与血清LDL水平无相关性。以上研究表明，基因多态性与血脂的关系因人种、性别、年龄及环境因素的差异而有所不同。目前众多研究者都认为PCSK9多态性与血清脂蛋白的改变密切相关，但与高胆固醇血症的关系尚无定论。
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3 PCSK9与冠心病
正常血脂情况下，血液中脂质进入血管壁，可以被血管壁巨噬细胞通过LDL受体摄取而及时清除和(或)通过其他系统转运出血管壁，不会有大量的脂质沉积。但随血液中脂质浓度升高，进入血管壁的脂质增加，巨噬细胞LDL受体清除途径受到负反馈调节，使血管壁中脂质含量增加，进而被氧化修饰，再通过巨噬细胞表面清道夫受体途径进人巨噬细胞内，由于该途径缺乏负反馈调节机制，巨噬细胞大量摄取氧化修饰的脂质而成为泡沫细胞，最终导致动脉粥样硬化发生。
但是大量的临床实践发现，有近50%发生急性冠脉综合征的患者血脂水平正常。此类患者中单纯用LDL负反馈调节机制很难解释脂质在血管壁积聚的原因，这表明有其他的机制参与其中。
在肝细胞，PCSK9能够降解肝细胞表面LDLR，影响肝脏对血液中LDL的清除，导致LDL水平升高。近来有研究发现，在单核细胞系(THP—1)分化而来的巨噬细胞(THP-1巨噬细胞)中，PCSK9有较高的表达，这为研究PCSK9与动脉粥样硬化发生的可能直接关系以及研究PCSK9与LDL受体两者之间的关系找到了一种新的细胞模型。
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刘录山等研究发现，在THP-1巨噬细胞中，与HepG-2、HEK293细胞一样，PCSK9与LDLR的表达也呈负相关。在THP-1巨噬细胞中，经oxLDL处理后，PCSK9和LDLR的表达均无明显变化，但是LDL处理细胞后发现在THP—1巨噬细胞中，LDLR表达降低，PCSK9表达增高，均呈浓度依赖性。
研究还发现，LDL处理THP-1巨噬细胞后，LDLR mR-NA与蛋白质下降水平程度不一致，这表明除了LDLR负反馈调节途径外，很可能是PCSK9在此发挥了对LDLR蛋白的直接作用导致了LDLR蛋白质水平的下降。这也可能是正常血脂水平患者发生急性冠脉综合征的原因，即在这部分患者中，可能存在PCSK9的高活性或高表达，使得血管壁巨噬细胞表面LDLR被降解，即使进入血管壁的脂质不多，但得不到清除，从而积聚并被氧化修饰，再通过清道夫受体途径被巨噬细胞摄取，导致泡沫细胞形成和动脉粥样硬化发生。这需要进一步的人群实验加以验证。
4 PCSK9在冠心病防治中的展望
PCSK9野生型可介导LDLR降解，升高LDL—c水平，增加冠心病、心肌梗死患病风险.然而突变型如Y142X、C679X却降低血脂水平和相关心血管疾病患病风险，故PCSK9有望成为调节胆固醇水平、减少心血管疾病发生的治疗靶标。分子生物学研究从分子水平探索PCSK9作用机制和突变机制，为异常胆固醇血症治疗提供新的思路。比如：PCSK9合成分泌需自身催化反应，采用自身催化特异敏感小分子抑制剂可抑制活性PCSK9生成；利用小分子抑制剂阻断PCSK9、LDLR作用，干扰二者结合，可降低LDL—c水平。另外，运用反义技术可能抑制人体肝PCSK9功能；针对PCSK9、LDLR复合物的抗体疗法也有广阔前景。, 百拇医药(邱 瑜 文红艳)
1 PCSK9简介
人类PCSK9基因定位于染色体lp32.3，长约22 kh，由信号肽、前结构域、催化结构域和羧基末端结构域(V结构域)顺次连接而成，所编码酸性糖蛋白各区域氨基酸序号分别为1～30、31～152、153～452、453～692。PCSK9蛋白合成分泌与其他前蛋白转化酶相似，内质网中合成PCSK9酶原(apo—PCSK9，74 kD)，apo—PCSK9于内质网或高尔基体中发生自身催化反应，在SVFAQ152处裂解释放前肽(14 kD)形成成熟蛋白酶(60 kD)并分泌人血。PCSK9主要在肝脏、肠道表达，在肾脏、皮肤、脑中只有少量表达。
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2 PCSK9与高脂血症
2.1 PCSK9与脂质代谢 脂类的内平衡受到固醇调节元件结合蛋白(sREBP)-la，-lb，和-2三种DNA结合蛋白的转录调控。SREBP属于螺旋一环一螺旋亮氨酸拉链转录因子家族，其主要功能是激活参与胆固醇和脂肪酸生物合成和代谢及LDLR合成的基因。研究发现，过度表达SREBP—la或SREBP-2的转活结构域的转基因小鼠有明显pcsk9的表达上调。细胞内低胆固醇或他汀药处理培养的肝细胞若胆固醇缺失，均可激活SREBPla、SREBP2.而SREBPI a和SREBP2过表达可上调pcsk9表达。在SREBP的转基因鼠中，pcsk9表达被明显抑制，证明pcsk9有可能是SREBP的靶基因。LDLR与体内低密度脂蛋白(LDL)的代谢密切相关，通过介导细胞摄取LDL，增加LDL的降解，对于血浆LDL维持于一相对恒定水平具有重要作用。LD.LR基因也是受SREBP-2调控的。研究表明，肝脏胆固醇的缺失可以激活SREBPs诱导pcsk9的表达增加从而调控LDLR水平。SREBP就是通过与LDLR的SRE结合来调控LDLR的转录，从而维持细胞内外LDL的平衡。将人pcsk9基因导入培养的细胞，并未见LDLR mRNA水平改变.但LDLR蛋白表达却显著减少，且细胞对荧光标记的LDL内吞功能显著降低。上述研究表明，pcsk9基因表达产物NARC—1降低细胞表面LDLR蛋白并干扰LDLR介导的细胞对胆固醇的摄取，但有研究者认为pcsk9基因可能不是通过传统的固醇调节元件介导的转录途径调节LDLR表达，而是通过新的机制调节LDLR功能。
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2.2 PCSK9基因多态性与高胆固醇血症Cunningham等研究发现，D374Y突变与FH和早发心血管疾病相关。突变型PCSK9在中性环境中与受体的结合力比野生型强25倍，而在酸性环境中则形成高亲和力的络合物。因此推断PCSK9可能通过直接结合而不一定是水解LDLR的机制减少细胞表面LDLR。Chen等t13 J发现.PCSK9的E670G(23968A>c)与血清LDL—C水平相关，GG型LDL—c水平最高，AG型LDL—c水平居中，AA型LDL—c水平最低。Camemn等发现了4个PCSK9功能缺失突变(R46L、G106R、N157K、R237W)与细胞表面LDLR表达和LDL内吞密切相关；而2个PCSIO增益突变(S127R和D374R)亦与细胞表面LDLR表达和LDL内吞有密切的关系。所谓功能增益型突变是指通过增加PCSK9的功能、降低LDLR的表达而升高血清胆固醇。Hallman等对478名非洲裔美国人和1086名白人研究发现.非洲裔美国人中X142和X679等位基因携带者比非携带者LDL—c水平低，白人中IA6等位基因携带者比非携带者LDL—c水平明显降低。Hooper等对653名非洲黑人女性研究发现.PCSK9基因C679X无义突变存在于3.7%的津巴布韦黑人中，该突变可引起LDL—c降低，但对HDL—c无影响。Co-hen等的研究也得到相似的结论。Yue等对403名高加索人的研究发现，PCSK9的c43 44插入CTG突变在高加索人中与血清LDL2C水平存在相关性，该突变在3个非洲裔美国人和高加索人家族性低B2脂蛋白血症家族中亦有发现，44插入CTG在高加索人中起降胆固醇的作用。Evance对506例血脂异常患者研究发现，PCSK9基因的E607G突变在男性中与LDL—c升高有相关性，而在女性中则无相关性。Chen等发现，PCSK9基因的E670G及23968A>G突变中G等位基因单倍体与高水平的LDL—c有相关性，但Kotowski等,发现该突变在德克萨斯人中与血清LDL水平无相关性。以上研究表明，基因多态性与血脂的关系因人种、性别、年龄及环境因素的差异而有所不同。目前众多研究者都认为PCSK9多态性与血清脂蛋白的改变密切相关，但与高胆固醇血症的关系尚无定论。
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3 PCSK9与冠心病
正常血脂情况下，血液中脂质进入血管壁，可以被血管壁巨噬细胞通过LDL受体摄取而及时清除和(或)通过其他系统转运出血管壁，不会有大量的脂质沉积。但随血液中脂质浓度升高，进入血管壁的脂质增加，巨噬细胞LDL受体清除途径受到负反馈调节，使血管壁中脂质含量增加，进而被氧化修饰，再通过巨噬细胞表面清道夫受体途径进人巨噬细胞内，由于该途径缺乏负反馈调节机制，巨噬细胞大量摄取氧化修饰的脂质而成为泡沫细胞，最终导致动脉粥样硬化发生。
但是大量的临床实践发现，有近50%发生急性冠脉综合征的患者血脂水平正常。此类患者中单纯用LDL负反馈调节机制很难解释脂质在血管壁积聚的原因，这表明有其他的机制参与其中。
在肝细胞，PCSK9能够降解肝细胞表面LDLR，影响肝脏对血液中LDL的清除，导致LDL水平升高。近来有研究发现，在单核细胞系(THP—1)分化而来的巨噬细胞(THP-1巨噬细胞)中，PCSK9有较高的表达，这为研究PCSK9与动脉粥样硬化发生的可能直接关系以及研究PCSK9与LDL受体两者之间的关系找到了一种新的细胞模型。
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刘录山等研究发现，在THP-1巨噬细胞中，与HepG-2、HEK293细胞一样，PCSK9与LDLR的表达也呈负相关。在THP-1巨噬细胞中，经oxLDL处理后，PCSK9和LDLR的表达均无明显变化，但是LDL处理细胞后发现在THP—1巨噬细胞中，LDLR表达降低，PCSK9表达增高，均呈浓度依赖性。
研究还发现，LDL处理THP-1巨噬细胞后，LDLR mR-NA与蛋白质下降水平程度不一致，这表明除了LDLR负反馈调节途径外，很可能是PCSK9在此发挥了对LDLR蛋白的直接作用导致了LDLR蛋白质水平的下降。这也可能是正常血脂水平患者发生急性冠脉综合征的原因，即在这部分患者中，可能存在PCSK9的高活性或高表达，使得血管壁巨噬细胞表面LDLR被降解，即使进入血管壁的脂质不多，但得不到清除，从而积聚并被氧化修饰，再通过清道夫受体途径被巨噬细胞摄取，导致泡沫细胞形成和动脉粥样硬化发生。这需要进一步的人群实验加以验证。
4 PCSK9在冠心病防治中的展望
PCSK9野生型可介导LDLR降解，升高LDL—c水平，增加冠心病、心肌梗死患病风险.然而突变型如Y142X、C679X却降低血脂水平和相关心血管疾病患病风险，故PCSK9有望成为调节胆固醇水平、减少心血管疾病发生的治疗靶标。分子生物学研究从分子水平探索PCSK9作用机制和突变机制，为异常胆固醇血症治疗提供新的思路。比如：PCSK9合成分泌需自身催化反应，采用自身催化特异敏感小分子抑制剂可抑制活性PCSK9生成；利用小分子抑制剂阻断PCSK9、LDLR作用，干扰二者结合，可降低LDL—c水平。另外，运用反义技术可能抑制人体肝PCSK9功能；针对PCSK9、LDLR复合物的抗体疗法也有广阔前景。, 百拇医药(邱 瑜 文红艳)