线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征有基底节钙化者的线粒体DNA突变情况观察(1)
[摘要] 目的通过对脑CT示基底节钙化的线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征(MELAS)患者的线粒体DNA(mitoehondrial DNA,mtDNA)突变进行研究,验证大部分MELAS综合征患者mtDNA突变位点在3243,探讨基底节钙化是否可作为线粒体病的筛选诊断指标。方法应用聚合酶链反应一限制性片断长度多态性(PCR—RFLP)方法对20例MEIAS综合征患者肌肉或外周血mtDNA的A3243G点突变进行检测,并将PCR产物进行DNA序列分析。结果经APaI酶切13例检测到A3243G点突变。侧序共14例检测到A3243G点突变。20例均无T3271C点突变。结论大部分MELAS综合征患者mtDNA突变位点在3243;基底节钙化与mtDNA异常关系密切,年轻患者的基底节钙化可作为线粒体病的筛选诊断指标。
[关键词]线粒体脑肌病;高乳酸血症;卒中样发作综合征;基底节钙化;DNA
[中图分类号]R743 [文献标识码]B [文章编号]1672-4208(2010)21-0066-03
, 百拇医药
MELAS是线粒体病中一个常见的综合征,其临床特征有突发性偏瘫、头痛、恶心,同时可伴有身材矮小、智力低下、神经性耳聋等。颅脑CT可见双侧基底节钙化,约占30%～70%(主要在苍白球占30%～80%),还可有脑梗死(其病灶范围与主要脑血管分布不一致)、脑室扩大、脑萎缩等。目前已知线粒体脑肌病是由线粒体DNA突变引起。为验证大部分MELAS综合征患者mtDNA突变位点在3243,进一步探索基底节钙化与mtDNA异常的关系,并探讨基底节钙化是否可作为线粒体病的筛选指标,笔者收集了20例有基底节钙化的MELAS综合征患者,并对这些患者的mtDNA片段进行检测,现报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料收集1999-2004年就诊于齐鲁医院神经内科有基底节钙化的MELAS综合征患者20例,其中男7例,女13例;年龄10～70岁,19例在40岁前发病,仅1例大于60岁,4例有家族史,2对为母子关系。20例中均有基底节钙化,肌肉病理均有不整边红纤维,电镜下可观察到异常线粒体。确诊为MELAS综合征。
, http://www.100md.com
1.2 实验方法
1.2.1 基因组DNA的提取用常规酚/氯仿法提取肌肉组织DNA,蛋白酶K-盐析法提取外周血DNA。
1.2.2 PCR的条件及检测方法 (1)引物设计:扩增A3243G的引物:上游引物:(5’-3')3116~3135:CCTCCCTGTACGAAAGGACA;下游引物:(5’-3')3609—3590:GCCTAGGGTIGAGGTrGACCA。扩增T3271C的引物:上游引物:同A3243G的上游引物。下游引物:(5’～3’)3301—3272:AATIECAGqL3ECAAGTrA-AGGAGAAGAAT;(2)PCR体系:10×Buffer(withMg2 mmol/L)10ul,模板DNA 2ul,Mixed dNTP(400 ul01)4ul,上游引物(400 pmol/L)4ul,下游引物(400 pmol/L)4 ul,Taq酶(5 U/100ul)1ul,其余体积用双蒸水补齐,PCR体系总体积100ul。(3)PCR循环:扩增:94度预变性3 min,94%变性1 min,56度退火1 min,72度延伸1 min,共30个循环,最后1个循环72度延伸10 min。(4)电泳:验证PCR产物。(5)PCR产物的纯化。(6)限制性片段长度多态性电泳上样缓冲液(Loading buffer)与10ul已酶切的PCR产物混匀,加入凝胶的上样孔中,同时在一上样孔加入5ul的DLl000 DNA marker。于1 xTAE环境、100 v电压,电泳60 min。电泳完毕,将凝胶置于AlphaImag-erTM2200型凝胶成像仪中显像,并将图像存入计算机。另一部分PCR纯化产物送上海生工生物技术有限服务公司测序,以验证PCR/RFLP结果。
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2 结果
2.1 限制性内切酶酶切结果经APaI酶切13例检测到A3243G点突变,其余7例未检测到A3243G点突变,检测到突变的13例中4例为母子关系,20例均未检测到T3271C点突变。
2.2 侧序结果共14例检测到A3243G点突变,其中13例PCR/RFLP酶切显示有A3243G点突变者,测序均检测到A3243G点突变;l例酶切未显示A3243G点突变而测序检测到此点突变者,同时有C3524G、C3527T碱基置换。20例均无T3271C点突变,但有C3524G碱基置换者3例,有A3537G的碱基置换者1例,有C3527T碱基置换者5例,有C3527A碱基置换者1例,有C3527G碱基置换者2例,C3497A碱基置换者4例。
3 讨论
线粒体病是由于线粒体功能异常而导致各种代谢过程异常的一组疾病。常见的线粒体病临床综合征为:线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征(MELAS)、肌阵挛陛癫痫伴不整红边纤维综合征(MERRF)、慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO/KSS.)、Leber遗传性视神经病(LHON)和Lei曲综合征。文献报道 MELAS综合征中基底节钙化的发生率为30%-70%(且主要在苍白球,约占30%一80%),多呈对称性分布,而MELAS综合征线粒体的tRNAv“(uort)基因(即A3243G点)是线粒体基因突变的“热点”,约占80%。因此,我们设计的引物在于扩增该区域。由于突变型mtDNA A3243G点突变产生了一个新的Apal~切位点,而野生型mtDNA无此酶酶切位点,因此,应用扩增A3243G的引物行PCR反应结束后,再用ApaI酶切,野生型mtDNA只有494 bp处一个条带,而突变型mtDNA因为A3243G点突变产生了一个新的Apa墙每切位点,所以被切成366 bp和128 bp,两个片段。在琼脂糖凝胶电泳时可见到366 bp和128 bp处两个新的条带。在本研究的20例患者中,13例通过酶切检测到A3243G点突变,且均为异质性突变。侧序结果显示20例病例中,14例有A3243G点突变,其中,13例PCR/RFLP酶切显示有A3243G点突变者,测序均检测到A3243G点突变;1例酶切未显示A3243G点突变而测序检测到此点突变者,同时有C3524G、C3527T碱基置换。提示PCR-RFLP检测中有假阴性结果,这可能与突变碱基周围的碱基序列的变异性有关,有待于进一步研究证实。
CM Sue等报道了他们研究的26例有A3243G点突变的MELAS综合征病例中14例有基底节钙化,也说明了基底节钙化是MELAS综合征病例的最常见, http://www.100md.com(刘新云 刘淑萍)
[关键词]线粒体脑肌病;高乳酸血症;卒中样发作综合征;基底节钙化;DNA
[中图分类号]R743 [文献标识码]B [文章编号]1672-4208(2010)21-0066-03
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MELAS是线粒体病中一个常见的综合征,其临床特征有突发性偏瘫、头痛、恶心,同时可伴有身材矮小、智力低下、神经性耳聋等。颅脑CT可见双侧基底节钙化,约占30%～70%(主要在苍白球占30%～80%),还可有脑梗死(其病灶范围与主要脑血管分布不一致)、脑室扩大、脑萎缩等。目前已知线粒体脑肌病是由线粒体DNA突变引起。为验证大部分MELAS综合征患者mtDNA突变位点在3243,进一步探索基底节钙化与mtDNA异常的关系,并探讨基底节钙化是否可作为线粒体病的筛选指标,笔者收集了20例有基底节钙化的MELAS综合征患者,并对这些患者的mtDNA片段进行检测,现报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料收集1999-2004年就诊于齐鲁医院神经内科有基底节钙化的MELAS综合征患者20例,其中男7例,女13例;年龄10～70岁,19例在40岁前发病,仅1例大于60岁,4例有家族史,2对为母子关系。20例中均有基底节钙化,肌肉病理均有不整边红纤维,电镜下可观察到异常线粒体。确诊为MELAS综合征。
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1.2 实验方法
1.2.1 基因组DNA的提取用常规酚/氯仿法提取肌肉组织DNA,蛋白酶K-盐析法提取外周血DNA。
1.2.2 PCR的条件及检测方法 (1)引物设计:扩增A3243G的引物:上游引物:(5’-3')3116~3135:CCTCCCTGTACGAAAGGACA;下游引物:(5’-3')3609—3590:GCCTAGGGTIGAGGTrGACCA。扩增T3271C的引物:上游引物:同A3243G的上游引物。下游引物:(5’～3’)3301—3272:AATIECAGqL3ECAAGTrA-AGGAGAAGAAT;(2)PCR体系:10×Buffer(withMg2 mmol/L)10ul,模板DNA 2ul,Mixed dNTP(400 ul01)4ul,上游引物(400 pmol/L)4ul,下游引物(400 pmol/L)4 ul,Taq酶(5 U/100ul)1ul,其余体积用双蒸水补齐,PCR体系总体积100ul。(3)PCR循环:扩增:94度预变性3 min,94%变性1 min,56度退火1 min,72度延伸1 min,共30个循环,最后1个循环72度延伸10 min。(4)电泳:验证PCR产物。(5)PCR产物的纯化。(6)限制性片段长度多态性电泳上样缓冲液(Loading buffer)与10ul已酶切的PCR产物混匀,加入凝胶的上样孔中,同时在一上样孔加入5ul的DLl000 DNA marker。于1 xTAE环境、100 v电压,电泳60 min。电泳完毕,将凝胶置于AlphaImag-erTM2200型凝胶成像仪中显像,并将图像存入计算机。另一部分PCR纯化产物送上海生工生物技术有限服务公司测序,以验证PCR/RFLP结果。
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2 结果
2.1 限制性内切酶酶切结果经APaI酶切13例检测到A3243G点突变,其余7例未检测到A3243G点突变,检测到突变的13例中4例为母子关系,20例均未检测到T3271C点突变。
2.2 侧序结果共14例检测到A3243G点突变,其中13例PCR/RFLP酶切显示有A3243G点突变者,测序均检测到A3243G点突变;l例酶切未显示A3243G点突变而测序检测到此点突变者,同时有C3524G、C3527T碱基置换。20例均无T3271C点突变,但有C3524G碱基置换者3例,有A3537G的碱基置换者1例,有C3527T碱基置换者5例,有C3527A碱基置换者1例,有C3527G碱基置换者2例,C3497A碱基置换者4例。
3 讨论
线粒体病是由于线粒体功能异常而导致各种代谢过程异常的一组疾病。常见的线粒体病临床综合征为:线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征(MELAS)、肌阵挛陛癫痫伴不整红边纤维综合征(MERRF)、慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO/KSS.)、Leber遗传性视神经病(LHON)和Lei曲综合征。文献报道 MELAS综合征中基底节钙化的发生率为30%-70%(且主要在苍白球,约占30%一80%),多呈对称性分布,而MELAS综合征线粒体的tRNAv“(uort)基因(即A3243G点)是线粒体基因突变的“热点”,约占80%。因此,我们设计的引物在于扩增该区域。由于突变型mtDNA A3243G点突变产生了一个新的Apal~切位点,而野生型mtDNA无此酶酶切位点,因此,应用扩增A3243G的引物行PCR反应结束后,再用ApaI酶切,野生型mtDNA只有494 bp处一个条带,而突变型mtDNA因为A3243G点突变产生了一个新的Apa墙每切位点,所以被切成366 bp和128 bp,两个片段。在琼脂糖凝胶电泳时可见到366 bp和128 bp处两个新的条带。在本研究的20例患者中,13例通过酶切检测到A3243G点突变,且均为异质性突变。侧序结果显示20例病例中,14例有A3243G点突变,其中,13例PCR/RFLP酶切显示有A3243G点突变者,测序均检测到A3243G点突变;1例酶切未显示A3243G点突变而测序检测到此点突变者,同时有C3524G、C3527T碱基置换。提示PCR-RFLP检测中有假阴性结果,这可能与突变碱基周围的碱基序列的变异性有关,有待于进一步研究证实。
CM Sue等报道了他们研究的26例有A3243G点突变的MELAS综合征病例中14例有基底节钙化,也说明了基底节钙化是MELAS综合征病例的最常见, http://www.100md.com(刘新云 刘淑萍)