hUCMSCs对半乳糖致衰老小鼠心脏保护作用(2)
1.2.2Western Blot检测HSP70和VEGF蛋白表达用RIPA裂解液裂解心脏组织,BCA法测定蛋白质含量,取等量的蛋白进行SDSPAGE凝胶电泳,至溴酚蓝到达分离胶底部,转移至PVDF膜上(200 mA、110 min),以含30 g/L BSA和50 g/L脱脂奶粉的TBST溶液封闭2 h,加一抗4 ℃摇床孵育过夜,加二抗室温孵育2 h,ECL显影,用凝胶成像分析仪捕捉图像,Quantity One软件分析条带灰度值。
1.2.3RTPCR方法检测NLRP3、IL18以及IL1β的mRNA表达采用TRIzol法提取各组心脏组织的总RNA,紫外线分光光度法测定并计算提取的总RNA含量及浓度,逆转录获得cDNA。采用RTPCR法检测炎症小体相关基因NLRP3、IL18和IL1β mRNA相对表达量。所用引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成,引物序列见表1。RTPCR反应条件:95 ℃、600 s;95 ℃、10 s,60 ℃、10 s,72 ℃、15 s,共45个循环;95 ℃、10 s ......
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