缬沙坦对球囊损伤大鼠主动脉内皮Apelin表达影响(1)
[摘要] 目的 观察大鼠主动脉球囊损伤后血管组织中Apelin的表达变化及缬沙坦治疗对其表达的影响，探讨缬沙坦在预防再狭窄中的作用及其机制。方法 将48只Wistar大鼠随机分为对照组、手术组及药物组，各16只。手术组和药物组大鼠用自制的2F球囊导管进行主动脉内皮损伤，构建大鼠主动脉内皮球囊损伤模型；对照组不行主动脉球囊损伤。药物组术前1 d～术后14 d(或28 d)给予缬沙坦(20 mg/(kg·d))进行干预。各组分别在术后14、28 d取主动脉组织，应用苏木精-伊红染色观察血管内膜的变化，实时荧光定量逆转录聚合酶链反应技术、免疫组织化学方法检测主动脉组织Apelin的mRNA和蛋白表达水平。结果 术后14、28 d手术组血管内膜较对照组显著增厚，药物组内膜厚度较手术组明显降低，差异有显著性(F=168.85、233.62，P<0.05)。手术组内皮损伤后14、28 d主动脉组织Apelin mRNA和蛋白表达较对照组显著升高，药物组Apelin mRNA和蛋白表达较手术组明显增加，差异有显著性(F=26.74～48.71，P<0.05)。结论 大鼠主动脉球囊损伤后血管组织中Apelin的表达升高，缬沙坦抑制主动脉球囊损伤后内膜增生可能与其上调Apelin的表达有关。
[关键词] 球囊损伤；Apelin；缬沙坦；冠状动脉再狭窄
[中图分类号] R563.1
[文献标志码] A
[文章编号] 2096-5532(2018)03-0334-04
经皮冠状动脉介入(PCI)术是目前公认治疗冠状动脉狭窄病变的有效手段[1]，但术后存在再狭窄的并发症，严重影响了PCI的疗效。药物涂层支架的引入和新型抗栓药物的应用有效降低了再狭窄的发生，但其发生率仍达5%[2-3]。为了进一步改善病人的长期预后，提高病人的生存质量，预防再狭窄的发生尤为重要。研究结果证实，血管平滑肌细胞的移行和增殖是发生动脉粥样硬化和PCI术后再狭窄的主要病理学基础。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)在降压、改善心肌重构等心血管疾病的治疗中发挥着重要作用。既往研究显示，缬沙坦可以通过抑制血管平滑肌细胞的移行及增殖，减轻血管内皮损伤后内膜的增生，降低术后再狭窄的发生[4]。Apelin是血管紧张素Ⅱ1型受体相关蛋白APJ的内源性配体[5]，广泛表达于体内的各种组织器官中。
近年来，Apelin在心血管疾病中的作用日益得到人们的关注。研究发现，Apelin在原发性高血压、心力衰竭病人的血浆中表达降低[6]，药物洗脱支架植入24 h后血浆Apelin的表达较支架植入前明显升高[7]。然而，关于Apelin在内皮损伤后血管组织中的变化尚未见报道。本实验通过观察血管內皮损伤后Apelin的表达变化及缬沙坦治疗对其表达的影响，探讨缬沙坦抑制大鼠主动脉球囊损伤后内膜增生的作用及其机制，为再狭窄的预防提供更多的理论依据。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 实验分组及处理
正常饮食的雄性Wistar大鼠48只，购自青岛市实验动物中心，将其随机分为对照组、手术组和药物组，各16只。手术组：腹腔注射100 g/L的水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，从大鼠左侧颈总动脉插入自制的2F球囊导管，并缓慢行至腹主动脉下端，以0.08～0.10 mL无菌氯化钠溶液充盈球囊，从不同方向抽拉导管3次，充分剥脱大鼠主动脉内膜。药物组：手术操作与手术组相同，术前1 d～术后14 d(或28 d)给予大鼠缬沙坦(20 mg/(kg·d))溶于2 mL生理盐水)灌胃。对照组：除不插入球囊进行损伤，其他处理同手术组。
1.2 标本采集及处理
各组分别在术后14、28 d取大鼠主动脉血管，每组各时间点均取8只。经腹腔注射100 g/L的水合氯醛(3 mL/kg)全身麻醉大鼠，置入体积分数0.75乙醇中浸泡5 s，在超净台中无菌条件下剪取长约5 cm的主动脉血管段，取近主动脉弓端约5 mm的血管置入40 g/L甲醛溶液中固定，制作石蜡切片。其余的主动脉血管放入-80 ℃冰箱冻存备用。
1.3 组织学检测
石蜡切片行苏木精-伊红(HE)染色及免疫组化检查。光镜下观察HE切片中血管平滑肌细胞移行、增殖以及内膜的变化，应用Simple PCI图像分析仪测量内膜和中膜的厚度[8]。
1.4 血管组织中Apelin mRNA表达测定
应用Trizol试剂(美国，Invitrogen公司)提取血管组织中总RNA，检验其纯度。应用RT-PCR试剂盒(德国Rothe公司)逆转录合成cDNA。逆转录条件：37 ℃、55 min；85 ℃、10 min；-20 ℃储存。根据SYBR Premix Ex Taq(大连宝生物公司)说明书在Light Cycler Real Time PCR扩增仪上进行SYBR Green I实时定量PCR反应，反应条件如下：95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共40个循环。Apelin及内参照β-actin的引物序列及产物长度见表1。以β-actin为管家基因，应用2-△△Ct法计算目的基因mRNA 的相对表达量[9]。
1.5 血管组织中Apelin蛋白表达检测
应用免疫组化法检测血管组织中Apelin的蛋白表达。主动脉组织石蜡切片，依次经二甲苯脱蜡、乙醇水化、内源性过氧化物酶阻断灭活，抗原修复，加入Apelin一抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)稀释液(稀释比例为1∶45)，PBS冲洗、二抗孵育漂洗，DAB显色，苏木精复染，常规脱水，透明，干燥，封片。应用Simple PCI图像分析软件随机测定高倍镜下5个不同区域Apelin的蛋白表达量。
1.6 统计学分析, 百拇医药(李婷婷 段硕 周经纬 王妮 李永红)
[关键词] 球囊损伤；Apelin；缬沙坦；冠状动脉再狭窄
[中图分类号] R563.1
[文献标志码] A
[文章编号] 2096-5532(2018)03-0334-04
经皮冠状动脉介入(PCI)术是目前公认治疗冠状动脉狭窄病变的有效手段[1]，但术后存在再狭窄的并发症，严重影响了PCI的疗效。药物涂层支架的引入和新型抗栓药物的应用有效降低了再狭窄的发生，但其发生率仍达5%[2-3]。为了进一步改善病人的长期预后，提高病人的生存质量，预防再狭窄的发生尤为重要。研究结果证实，血管平滑肌细胞的移行和增殖是发生动脉粥样硬化和PCI术后再狭窄的主要病理学基础。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)在降压、改善心肌重构等心血管疾病的治疗中发挥着重要作用。既往研究显示，缬沙坦可以通过抑制血管平滑肌细胞的移行及增殖，减轻血管内皮损伤后内膜的增生，降低术后再狭窄的发生[4]。Apelin是血管紧张素Ⅱ1型受体相关蛋白APJ的内源性配体[5]，广泛表达于体内的各种组织器官中。
近年来，Apelin在心血管疾病中的作用日益得到人们的关注。研究发现，Apelin在原发性高血压、心力衰竭病人的血浆中表达降低[6]，药物洗脱支架植入24 h后血浆Apelin的表达较支架植入前明显升高[7]。然而，关于Apelin在内皮损伤后血管组织中的变化尚未见报道。本实验通过观察血管內皮损伤后Apelin的表达变化及缬沙坦治疗对其表达的影响，探讨缬沙坦抑制大鼠主动脉球囊损伤后内膜增生的作用及其机制，为再狭窄的预防提供更多的理论依据。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 实验分组及处理
正常饮食的雄性Wistar大鼠48只，购自青岛市实验动物中心，将其随机分为对照组、手术组和药物组，各16只。手术组：腹腔注射100 g/L的水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，从大鼠左侧颈总动脉插入自制的2F球囊导管，并缓慢行至腹主动脉下端，以0.08～0.10 mL无菌氯化钠溶液充盈球囊，从不同方向抽拉导管3次，充分剥脱大鼠主动脉内膜。药物组：手术操作与手术组相同，术前1 d～术后14 d(或28 d)给予大鼠缬沙坦(20 mg/(kg·d))溶于2 mL生理盐水)灌胃。对照组：除不插入球囊进行损伤，其他处理同手术组。
1.2 标本采集及处理
各组分别在术后14、28 d取大鼠主动脉血管，每组各时间点均取8只。经腹腔注射100 g/L的水合氯醛(3 mL/kg)全身麻醉大鼠，置入体积分数0.75乙醇中浸泡5 s，在超净台中无菌条件下剪取长约5 cm的主动脉血管段，取近主动脉弓端约5 mm的血管置入40 g/L甲醛溶液中固定，制作石蜡切片。其余的主动脉血管放入-80 ℃冰箱冻存备用。
1.3 组织学检测
石蜡切片行苏木精-伊红(HE)染色及免疫组化检查。光镜下观察HE切片中血管平滑肌细胞移行、增殖以及内膜的变化，应用Simple PCI图像分析仪测量内膜和中膜的厚度[8]。
1.4 血管组织中Apelin mRNA表达测定
应用Trizol试剂(美国，Invitrogen公司)提取血管组织中总RNA，检验其纯度。应用RT-PCR试剂盒(德国Rothe公司)逆转录合成cDNA。逆转录条件：37 ℃、55 min；85 ℃、10 min；-20 ℃储存。根据SYBR Premix Ex Taq(大连宝生物公司)说明书在Light Cycler Real Time PCR扩增仪上进行SYBR Green I实时定量PCR反应，反应条件如下：95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共40个循环。Apelin及内参照β-actin的引物序列及产物长度见表1。以β-actin为管家基因，应用2-△△Ct法计算目的基因mRNA 的相对表达量[9]。
1.5 血管组织中Apelin蛋白表达检测
应用免疫组化法检测血管组织中Apelin的蛋白表达。主动脉组织石蜡切片，依次经二甲苯脱蜡、乙醇水化、内源性过氧化物酶阻断灭活，抗原修复，加入Apelin一抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)稀释液(稀释比例为1∶45)，PBS冲洗、二抗孵育漂洗，DAB显色，苏木精复染，常规脱水，透明，干燥，封片。应用Simple PCI图像分析软件随机测定高倍镜下5个不同区域Apelin的蛋白表达量。
1.6 统计学分析, 百拇医药(李婷婷 段硕 周经纬 王妮 李永红)