散发性肥厚型心肌病MYH7基因突变位点筛查(2)
1.2尸体解剖所有研究对象均经系统尸体解剖检查,并取心、肝、脾、肾、肺、脑等主要器官进行组织病理学检查。
1.3基因组DNA提取
用石蜡切片机(LEICA RM2235)切取研究对象的甲醛固定石蜡包埋组织,利用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(TIANGEN,离心柱型)提取心脏标本基因组DNA。
1.4聚合酶链反应(PCR)及产物克隆
根据NCBI GenBank中的MYH7基因序列,应用Primer blast引物设计软件并根据含侧翼内含子序列进行相应外显子引物设计(表1)。设计的引物由上海生物工程公司合成。所用PCR扩增试剂为Premix TaqTM(EX TaqTM Version 2.0)。PCR反应体系25 μL,其内含有DNA模板2.0 μL,Premix 12.5 μL,上、下游引物各3 μmol/L,灭菌水4.5 μL。PCR扩增条件:98 ℃、10 s,55~62 ℃、30 s,72 ℃、1 min,循环35次。扩增产物由上海生物工程公司进行克隆测序。
1.5突变位点的确定及物种间保守性分析
运用Chromas程序 ......
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