PMA对少突胶质细胞铁相关蛋白表达的影响(1)
[摘要]目的 探讨4-b-佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)对未分化和分化的MO3.13少突胶质细胞铁相关蛋白表达的影响。
方法将MO3.13细胞分为对照组和PMA组。对照组用基础培养液进行细胞培养，PMA组的培养液内加入终浓度为100nmol/L的PMA，每3d换1次液。培养7d后，采用蛋白质免疫印迹实验检测两组细胞转铁蛋白受体1(TfR1)和铁调节蛋白1(IRP1)的表达水平。
结果与对照组相比，PMA组细胞TfR1和IRP1的表达水平均显著降低(t=3.002、2.654，P<0.05)。
结论100nmol/L的PMA可引起少突胶质细胞TfR1和IRP1的表达降低，这种变化可能与IRP1的调节有关。
[关键词]乙酸盐类;少突神经胶质;受体，转铁蛋白;铁调节蛋白质1
[中图分类号]R338.2
[文献标志码]A
[文章编号]2096-5532(2020)01-0014-03
帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病，其主要临床表现为静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势反射异常等[1-2]。有研究结果表明，铁沉积和氧化应激是PD的两个主要的病理特征[3-4]。铁对于细胞发育和维持中枢神经系统的各个生理过程至关重要，例如氧气运输、DNA合成、线粒体呼吸、髓磷脂合成和神经递质代谢等[5-6]。少突胶质细胞是中枢神经系统中形成髓鞘的细胞，它是由少突胶质细胞前体细胞(OPCs)分化而形成的[7-8]。铁蛋白是中枢神经系统中的主要储存蛋白，且在少突胶质细胞中检测到最高表达水平。因此，少突胶质细胞也是中枢神经系统中重要的铁调节细胞[9-11]。4-b-佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)是一种广泛用于体内外实验的蛋白激酶C(PKC)激活剂，它可以结合PKC，并激活PKC，随后导致一系列的细胞反应。有研究结果表明，未分化的MO3.13细胞在加入含100nmol/L的PMA的无血清培养液中培养7d后，检测到髓磷脂碱性蛋白(MBP)的免疫反应性大幅度上调[12]。然而，PMA是否影响少突胶质细胞内铁相关蛋白的表达，目前仍不清楚。本实验旨在探讨PMA对MO3.13少突胶质细胞内铁相关蛋白表达的影响，从而为PD的防治提供实验依据。现将结果报告如下。
1材料与方法
1.1材料
MO3.13少突膠质细胞购自于上海拜力生物科技有限公司。DMEM高糖培养基、胰酶均购自美国Hyclone公司，胎牛血清(FBS)购自Gibco公司，PMA、兔抗属单克隆一抗转铁蛋白受体1(TfR1)和铁调节蛋白1(IRP1)均购自Sigma公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自Absin公司，青霉素-链霉素溶液(100×)购自江苏海门碧云天生物技术研究所，BCA蛋白定量检测试剂盒为Thermo公司产品。所使用的仪器包括CO2培养箱、超净工作台和Western显影仪等。
1.2细胞培养及分组
将放置在液氮中的未分化MO3.13少突胶质细胞冻存管快速转移至37℃恒温水浴锅中进行融化。在超净工作台中将融化的未分化MO3.13少突胶质细胞从细胞冻存管中吸出，转至离心管中，再补入10mL的MO3.13少突胶质细胞完全培养液，用于稀释冻存液中的有害成分。将离心管放于离心机中，以1000r/min离心5min，沉淀细胞。弃上清，重新加入细胞培养液，用滴管吹打细胞后转入细胞培养瓶中，置于37℃、含体积分数0.05CO2的细胞培养箱中培养。当培养瓶中的细胞长至90%融合时，将细胞接种于6孔细胞板中，用MO3.13少突胶质细胞完全培养液培养24h，将原有的细胞培养液弃掉，加入含100nmol/LPMA的无血清培养液，置于37℃、含体积分数0.05CO2的细胞培养箱中培养。每3d换1次液，培养7d后，采用免疫荧光摄片的方法检测到成熟少突胶质细胞的标记物MBP的表达率大于90%，证明未分化的MO3.13少突胶质细胞分化成分化的MO3.13少突胶质细胞。本实验将细胞分为对照组(未分化的MO3.13少突胶质细胞)和PMA组(分化的MO3.13少突胶质细胞)。
1.3蛋白质免疫印迹实验检测铁相关蛋白表达
提取两组细胞蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，根据蛋白浓度计算每个样本的上样量。蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，采用100g/L的脱脂奶粉室温封闭2h，再分别加入β-actin(1∶10000)、TfR1(1∶1000)和IRP1(1∶1000)抗体，4℃下在摇床上孵育过夜。以TBST洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗，室温下在摇床上孵育1h。再以TBST洗膜3次后，用ECL发光剂显影。应用ImageJ软件分析条带灰度值，结果以TfR1/β-actin和IRP1/β-actin的比值表示。实验重复3次。
1.4统计学分析
应用GraphPadPrism5.0软件进行统计学处理，结果以[AKx-D]±s表示，两组间比较采用t检验。
2结果
结果表明，PMA组细胞TfR1和IRP1蛋白的表达水平均明显低于对照组，差异均有统计学意义(t=3.002、2.654，P<0.05)。见表1。
3讨论
铁是生物体正常代谢所必需的微量元素，对大脑的发育至关重要[2，13]。不同的神经胶质细胞由不同的铁相关蛋白来调节细胞对铁的摄取。在人类中，无论是未分化的还是分化的少突胶质细胞，铁的转入都是通过TfR1介导转铁蛋白(Tf)或铁蛋白的摄取[14-15]。TfR1也被称为CD71，是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，在细胞表面上广泛表达，是介导细胞内铁摄取的主要受体[16]。有研究表明，TfR1是细胞铁稳态的关键调节剂，是参与铁吸收和细胞生长调节的必需蛋白质[17-18]。IRPs是铁代谢相关蛋白转录后调节的最重要的因素[19]。在铁缺乏期间，IRP1通过与铁反应元件(IRE)的一小部分mRNA转录物结合来提高铁水平，从而调节其翻译并维持体内铁的稳态[20]。IRP1与IRE结合可以抑制mRNA的翻译或增加mRNA的稳定性。当前的研究发现，IRE结构存在于TfR1mRNA的3′非翻译区。当IRP1与IRE结合时，TfR1mRNA的稳定性将得到提高，进而增加TfR1的表达[21]。本实验结果表明，PMA可同时降低分化的少突胶质细胞IRP1与TfR1的蛋白表达。推测PMA首先通过降低细胞IRP1的表达，进而使IRP1与TfR1mRNA的3′非翻译区的IRE结合率降低，从而降低细胞TfR1的表达，但其机制还有待进一步研究。, 百拇医药(杜臣臣 谢俊霞 王俊)
方法将MO3.13细胞分为对照组和PMA组。对照组用基础培养液进行细胞培养，PMA组的培养液内加入终浓度为100nmol/L的PMA，每3d换1次液。培养7d后，采用蛋白质免疫印迹实验检测两组细胞转铁蛋白受体1(TfR1)和铁调节蛋白1(IRP1)的表达水平。
结果与对照组相比，PMA组细胞TfR1和IRP1的表达水平均显著降低(t=3.002、2.654，P<0.05)。
结论100nmol/L的PMA可引起少突胶质细胞TfR1和IRP1的表达降低，这种变化可能与IRP1的调节有关。
[关键词]乙酸盐类;少突神经胶质;受体，转铁蛋白;铁调节蛋白质1
[中图分类号]R338.2
[文献标志码]A
[文章编号]2096-5532(2020)01-0014-03
帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病，其主要临床表现为静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势反射异常等[1-2]。有研究结果表明，铁沉积和氧化应激是PD的两个主要的病理特征[3-4]。铁对于细胞发育和维持中枢神经系统的各个生理过程至关重要，例如氧气运输、DNA合成、线粒体呼吸、髓磷脂合成和神经递质代谢等[5-6]。少突胶质细胞是中枢神经系统中形成髓鞘的细胞，它是由少突胶质细胞前体细胞(OPCs)分化而形成的[7-8]。铁蛋白是中枢神经系统中的主要储存蛋白，且在少突胶质细胞中检测到最高表达水平。因此，少突胶质细胞也是中枢神经系统中重要的铁调节细胞[9-11]。4-b-佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)是一种广泛用于体内外实验的蛋白激酶C(PKC)激活剂，它可以结合PKC，并激活PKC，随后导致一系列的细胞反应。有研究结果表明，未分化的MO3.13细胞在加入含100nmol/L的PMA的无血清培养液中培养7d后，检测到髓磷脂碱性蛋白(MBP)的免疫反应性大幅度上调[12]。然而，PMA是否影响少突胶质细胞内铁相关蛋白的表达，目前仍不清楚。本实验旨在探讨PMA对MO3.13少突胶质细胞内铁相关蛋白表达的影响，从而为PD的防治提供实验依据。现将结果报告如下。
1材料与方法
1.1材料
MO3.13少突膠质细胞购自于上海拜力生物科技有限公司。DMEM高糖培养基、胰酶均购自美国Hyclone公司，胎牛血清(FBS)购自Gibco公司，PMA、兔抗属单克隆一抗转铁蛋白受体1(TfR1)和铁调节蛋白1(IRP1)均购自Sigma公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自Absin公司，青霉素-链霉素溶液(100×)购自江苏海门碧云天生物技术研究所，BCA蛋白定量检测试剂盒为Thermo公司产品。所使用的仪器包括CO2培养箱、超净工作台和Western显影仪等。
1.2细胞培养及分组
将放置在液氮中的未分化MO3.13少突胶质细胞冻存管快速转移至37℃恒温水浴锅中进行融化。在超净工作台中将融化的未分化MO3.13少突胶质细胞从细胞冻存管中吸出，转至离心管中，再补入10mL的MO3.13少突胶质细胞完全培养液，用于稀释冻存液中的有害成分。将离心管放于离心机中，以1000r/min离心5min，沉淀细胞。弃上清，重新加入细胞培养液，用滴管吹打细胞后转入细胞培养瓶中，置于37℃、含体积分数0.05CO2的细胞培养箱中培养。当培养瓶中的细胞长至90%融合时，将细胞接种于6孔细胞板中，用MO3.13少突胶质细胞完全培养液培养24h，将原有的细胞培养液弃掉，加入含100nmol/LPMA的无血清培养液，置于37℃、含体积分数0.05CO2的细胞培养箱中培养。每3d换1次液，培养7d后，采用免疫荧光摄片的方法检测到成熟少突胶质细胞的标记物MBP的表达率大于90%，证明未分化的MO3.13少突胶质细胞分化成分化的MO3.13少突胶质细胞。本实验将细胞分为对照组(未分化的MO3.13少突胶质细胞)和PMA组(分化的MO3.13少突胶质细胞)。
1.3蛋白质免疫印迹实验检测铁相关蛋白表达
提取两组细胞蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，根据蛋白浓度计算每个样本的上样量。蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，采用100g/L的脱脂奶粉室温封闭2h，再分别加入β-actin(1∶10000)、TfR1(1∶1000)和IRP1(1∶1000)抗体，4℃下在摇床上孵育过夜。以TBST洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗，室温下在摇床上孵育1h。再以TBST洗膜3次后，用ECL发光剂显影。应用ImageJ软件分析条带灰度值，结果以TfR1/β-actin和IRP1/β-actin的比值表示。实验重复3次。
1.4统计学分析
应用GraphPadPrism5.0软件进行统计学处理，结果以[AKx-D]±s表示，两组间比较采用t检验。
2结果
结果表明，PMA组细胞TfR1和IRP1蛋白的表达水平均明显低于对照组，差异均有统计学意义(t=3.002、2.654，P<0.05)。见表1。
3讨论
铁是生物体正常代谢所必需的微量元素，对大脑的发育至关重要[2，13]。不同的神经胶质细胞由不同的铁相关蛋白来调节细胞对铁的摄取。在人类中，无论是未分化的还是分化的少突胶质细胞，铁的转入都是通过TfR1介导转铁蛋白(Tf)或铁蛋白的摄取[14-15]。TfR1也被称为CD71，是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，在细胞表面上广泛表达，是介导细胞内铁摄取的主要受体[16]。有研究表明，TfR1是细胞铁稳态的关键调节剂，是参与铁吸收和细胞生长调节的必需蛋白质[17-18]。IRPs是铁代谢相关蛋白转录后调节的最重要的因素[19]。在铁缺乏期间，IRP1通过与铁反应元件(IRE)的一小部分mRNA转录物结合来提高铁水平，从而调节其翻译并维持体内铁的稳态[20]。IRP1与IRE结合可以抑制mRNA的翻译或增加mRNA的稳定性。当前的研究发现，IRE结构存在于TfR1mRNA的3′非翻译区。当IRP1与IRE结合时，TfR1mRNA的稳定性将得到提高，进而增加TfR1的表达[21]。本实验结果表明，PMA可同时降低分化的少突胶质细胞IRP1与TfR1的蛋白表达。推测PMA首先通过降低细胞IRP1的表达，进而使IRP1与TfR1mRNA的3′非翻译区的IRE结合率降低，从而降低细胞TfR1的表达，但其机制还有待进一步研究。, 百拇医药(杜臣臣 谢俊霞 王俊)