海洋鱼类致病菌鳗弧菌MVM425毒力质粒pEIB1复制区域的最小化分析
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摘要：目的研究pEIB1复制区域的最小化。方法分析已获得的pEIB1复制区域，设计了7种亚克隆方案。结果在7种亚克隆方案中仅pEIB8，pEIB9和pEIB73获得成功，并且3者的复制特性有差别。结论分析pEIB8，pEIB9和pEIB73携带的复制片段的差别，发现pEIB1复制区域1~360 bp存在的4个质粒复制蛋白结合位点(iteron)与质粒复制拷贝数的控制关系密切。
关键词：鳗弧菌；毒力质粒；复制区；亚克隆；质粒复制蛋白结合位点
中图分类号：R973文献标识码：A文章编号：1672-979x(2007)04-0001-04
Minimization Analysis of Replication Region of Virulent Plasmid pEIB1 from Marine Fish Pathogen Vibrio anguillarum MVM425
WU Hai-zhen, ZHANG Hui-zhan, LI Gang, YE Jiang, MA Yue, ZHANG Yuan-xing
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)
Abstract：Objective To minimize the replication region of the plasmid pEIB1. Methods Seven different subcloning projects were designed and carried out after the DNA sequence of pEIB1 replication region was analyzed. Results Only pEIB8, pEIB9 and pEIB73 were obtained among the seven subclones and these three plasmids show difference in replication characters. Conclusion Four iterons among 1~360bp of pEIB1 replication region may be associated with the plasmid copy number control when we analyzed the DNA sequences which pEIB8, pEIB9 and pEIB73 contained.
Key words：Vibrio anguillarum; virulent plasmid; replication region; subclone; iteron
弧菌病是水产养殖业的最大危害之一，其宿主范围广泛，包括养殖和野生鱼类。据报道，目前已有14个国家出现过弧菌病，侵染了48种海水鱼类[1]。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是海水和淡水养殖鱼类弧菌病的最主要病原菌，属革兰阴性菌，能使鳗鱼患败血症[2]，此种症状与人被Vibrio vulnificus感染产生的败血症非常相似[3，4]。
研究表明，鳗弧菌致病的主要原因是携带了约65 kb的毒力型质粒，在铁限制条件下，此质粒编码了高效铁摄取系统克服宿主细胞的非特异性免疫机制，消除此质粒能大幅度降低此病原菌的毒力[2]。
在前期研究中，我们从黄海山东海域高密度养殖鲈鱼(Lateolabrax japonicus)爆发的弧菌病病原体内分离到了鳗弧菌MVM425，对其携带的毒力质粒pEIB1进行了序列测定与分析[5，6]，进一步确定了此毒力质粒复制区域的相对位置[6]。目前鳗弧菌类似毒力质粒的复制位点、复制机制、复制拷贝数和控制机制尚未见报道。本研究对上述复制区域进行了DNA序列分析，在此基础上尝试对此DNA序列片段进行多种亚克隆，以期找到毒力质粒pEIB1的最小复制单位(复制位点)，为揭示毒力质粒复制的基本特性提供研究基础。
1材料和方法
1.1菌株、培养基及质粒
菌株 Escherichia coli JM83 系本实验室收藏；LB培养基(0.5%酵母粉，1%蛋白胨，1%NaCl)，液体或固体培养基37 ℃培养12～16 h。
质粒 pEIB7，含鳗弧菌 MVM425毒力质粒 pEIB1复制区域的质粒，由前期研究获得[6]；pUC18系本实验室收藏；pHXF在pUC21的 HindIII/SmaI位点插入1.3 kb的HindIII/SmaI DNA片段，此片段携带来源于质粒 pNF3[7]的卡那霉素抗性基因，由本研究构建；pMD72，pMD73，pMD74和pMD76由本研究构建。
1.2引物序列
Prep1: 5?AGCAGTGTCCAGTATGACCGTTT 3挘籔rep2: 5?GCGGAT CCATCGTCCGTACATA 3挘籔rep3: 5?GTGGATCCAAGCTGCTTAATCC 3挘籔rep4: 5?CGGG ATCCAAAGGCACTTATT 3挘籔rep6: 5?GCTGCTTCCTA AGTGGCCA 3?1.3常规DNA操作方法
DNA制备，酶切分析，连接与转化，电泳分析，PCR等方法参见文献[8]。
2结果
2.1毒力质粒pEIB1复制区域序列特征的分析
用序列分析软件 DNAStar分析 pEIB1复制区域(12516～13957 bp)序列，结果见图1。
整个序列全长1 441 bp，(G+C)含量为42.5%，在公共数据库中未找到明显相似的序列，有复制起始典型结构[9]AT富含区(图1斜体部分)，11个可能的 DnaA结合位点[10]，3个dam甲基化位点(GATC)，多个正向和反向短重复序列。其中最大的正向重复序列为11 bp，反向重复序列为20 bp，并且有1个回文结构(10 bp)。这些序列特征在已鉴定的复制子如大肠杆菌染色体复制子oriC[11]、质粒F的复制子ori2[12]、质粒pMJ101[13]复制子中均普遍存在，并且AT富含区(见表1)及DnaA结合位点(见表2)均有较高的同源性。
斜体部分的序列为AT-富含区；上方有实线箭头的序列为可能的DnaA结合位点；虚线箭头指示的是20-bp反向重复序列；长点虚线箭头指示的是11-bp 正向重复序列；双划线序列为回文结构；单划线序列为GATC序列；带框序列为亚克隆中设计的引物相对位置。
2.2毒力质粒pEIB1复制区域的亚克隆
分析DNA片段序列后，设计了7个亚克隆方案，见图2。拟对pEIB1复制区域进行缩小化研究。, 百拇医药(吴海珍 张惠展 李 刚 叶 江 马 悦 张元兴)