苦瓜中胰蛋白酶抑制剂活性的测定方法研究
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摘要：目的用一种改进的测定方法，测定从苦瓜籽中提取分离的胰蛋白酶抑制剂的抑制活性。方法通过稳定性、重复性和专属性实验，分析和考察此测定方法。结果苦瓜籽中的胰蛋白酶抑制剂的相对分子质量1×103，比活1 153 U/mg；配制的抑制剂在2 h内测得的活性变化小于2%；RSD 2.5%；0.05 mg/mL牛血清白蛋白对测定体系没有干扰。结论此方法适用于苦瓜胰蛋白酶抑制剂活性的测定。
关键词：苦瓜；分离；胰蛋白酶抑制剂；测定方法
中图分类号：Q55文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)04-0014-04
Study on Measurement Method for Activity of Trypsin Inhibitors from Momordica charantia
FU Zhong-ping, ZHOU Ji-yan, WANG Fu-jun*
(Institute of Traditional Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203, China)
Abstract：Objective To study a modified method for detecting inhibitory activities of trypsin inhibitors purified from Momordica charantia (MC) seeds. Methods The method was assessed by the stability, repeatability and specificity tests. Results The relative molecular mass of trypsin inhibitors from MC was around 1×103; specific activity was 1 153U/mg; the inhibitor solution was stable and the activity lose was less than 2% within 2 h; RSD of the method was 2.5% and 0.05mg/ml BSA did not interfere the activity measurement. Conclusion The method is suitable for the determination of inhibitory activities of trypsin inhibitors from MC.
Key words：Momordica charantia; separation; trypsin inhibitor; measurement
蛋白酶抑制剂是一类多肽，广泛存在于动物、植物和微生物中。由于在抗肿瘤、抗病毒等方面的功效，蛋白酶抑制剂倍受关注，其生物活性测定方法的可靠性和可比性也愈显重要。现在比较常用的有Hiroshi 等[1]提出的测定方法，但该方法对不同浓度的同一抑制剂的活性测定误差较大。本研究采用了一种改进的测定苦瓜中提取的蛋白酶抑制剂活性的方法，并考察了该方法的稳定性、重复性和专属性，验证了其可行性。
1仪器与材料
1.1仪器
752紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；冷冻离心机(Beckman)；5415D离心机(Eppendorf)；粉碎机(Philips)；冷冻干燥机(Labconco)；透析袋(Green bird)。
1.2材料
苦瓜种子(四川德昌永华贸易有限公司)；胰蛋白酶(上海阿敏生物技术有限公司)；苯甲酰精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE，C15H22N4O3-HCl，上海三杰生物)；低分子量蛋白marker(上海升正生物技术有限公司)；牛血清白蛋白(BSA，华美生物工程公司)。
2方法
2.1胰蛋白酶抑制剂提取
参考Nobuaki等[2]的提取方法。提取液在100 ℃沸水中水浴10 min之后，上清液中加硫酸铵至50%饱和度，沉淀2 h后离心去除沉淀；上清液中加硫酸铵至90 %饱和度，离心收集沉淀。将沉淀用蒸馏水透析(MWCO为1×103的透析袋)，将透析液常温10 000 rpm/min离心10 min，上清冷冻干燥得干燥粉末。
2.2SDS-PAGE 检测苦瓜胰蛋白酶抑制剂
按照SDS-PAGE低分子量marker说明书，分离胶为12.5%，浓缩胶为5.5%。
2.3胰蛋白酶活性测定
测定方法参照中国药典2000年版二部734页。
取底物BAEE溶液(底物8.57 mg，溶于100 mL pH 7.6 0.067 mol/L的 KH2PO4-Na2HPO4缓冲液。以水作空白，用该缓冲液调节A253nm在0.575～0.585之间)3.0 mL，加0.001 mol/L 的HCl 100μL ......
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