胰激肽原酶的制备方法和质量控制
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摘要：介绍了胰激肽原酶的制备方法和质量控制，并对其研究与开发的思路进行了讨论。
关键词：胰激肽原酶；制备方法；质量控制
中图分类号：Q556+.3文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)08-0025-04
激肽原酶(kininogenase，EC 3.4.21.8)是一组具有特异性、局限性蛋白质水解作用的丝氨酸蛋白酶，又称激肽释放酶(kallikrein)。它能使底物激肽原(kininogen) 释放出一类多肽即激肽(kinin)，而激肽对体内的血管和平滑肌有明显的作用。
激肽是在结构上相似的一类多肽激素，主要由不同专一性激肽原酶作用于激肽原而产生。以九肽的舒缓激肽(bradykinin)生物活性最强，是由血液中激肽原酶的作用产生的；其次是十肽的胰激肽(kallidin)，是由胰腺等组织中的激肽原酶作用于胰激肽原(kallidingogen)产生的。因此，由胰腺制得的激肽原酶称为胰激肽原酶(kallidinogenase)。我国药品标准将英文名定为 pancreatic kininogenase更为一目了然[1，2]。
现对胰激肽原酶的制备方法和质量作一介绍，并对其研究与开发思路进行讨论。
1制备方法
1.1传统工艺
先将0 ℃以下的丙酮加入猪胰脏中，于0 ℃左右脱水，制得干燥粉。用稀醋酸提取干燥粉，提取液加冷丙酮沉淀，乙醚脱脂，得沉淀物。此沉淀物用稀氯化钠溶液溶解，在pH 8过滤，滤液加冷丙酮使浓度达40 %，离心后清液中补加冷丙酮至浓度为60%，离心，洗涤沉淀并干燥即为酶的粗品。
将粗品溶于pH 4.5的稀醋酸盐缓冲液，离心，清液加入弱酸性阳离子树脂吸附，用pH 4.5的氯化钠溶液洗脱，洗脱液透析脱盐，冻干，即得精品[3]。
此工艺可用丙酮脱水及时处理胰脏，保持酶活性，便于贮存，合并批量投料。然后利用pH 8和pH 4.5介质去除部分杂质，再用丙酮分级沉淀得粗品。
胰激肽原酶的等电点为3.9~4.1，在pH 4.5以下不稳定，故在pH 4.5条件下以弱酸性树脂吸附。这里树脂与酶之间的结合部分是离子的，部分是疏水结合[1]。
李立恒等[4]改进了传统工艺。采用加入对酶有激活作用的Ca2+盐酸溶液取代醋酸提取干燥粉，由搅拌树脂吸附，改为柱色谱，明显提高了产品收率和比活。
1.2DEAE-纤维素吸附工艺
丙酮制成干燥粉，用稀醋酸钠(pH 6，内含CaCl2)提取，离心，上清液55 ℃处理5 min，离心去沉淀，用氢氧化钠调pH至7，加丙酮沉淀、抽滤，滤液加水稀释。
在稀释液中加DEAE-纤维素(pH 7磷酸盐缓冲液平衡)吸附，氯化铵溶液洗脱，洗脱液用冷丙酮70%浓度沉淀，干燥得粗品。
粗品溶解后调pH至5，上DEAE-纤维素色谱柱(pH 5醋酸钠缓冲液平衡),用浓度较大的醋酸钠缓冲液洗脱，收集酶活性部分，减压浓缩，对蒸馏水透析。
透析液调pH至6.7，上DEAE-Sepharose CL-6B柱(pH 6.7醋酸钠缓冲液平衡)，用浓度较大的醋酸钠缓冲液洗脱，得2个活性峰，减压浓缩，蒸馏水透析，真空干燥得产品[5]。
此工艺是使介质的pH大于酶的等电点，用阴离子交换树脂利用不同pH进行纯化。从生产的角度，笔者认为可省去DEAE-Sepharose CL-6B色谱步骤，因为该酶产品不需将两种活性成分分离。
对上述两种工艺加以分析，可以看出：(1)利用不同pH介质，用离子交换剂进行纯化是适当的。随着近年不断推出新的离子交换剂，宜选用更适当的吸附剂；(2)早年用透析去掉小分子杂质效率较低，可改用大型超滤设备，既可去掉小分子杂质，又可达到浓缩的目的；(3)在以胰脏为原料的生产过程中，Ca2+既有激活酶的作用，又有稳定酶的效果，是常规的步骤之一；(4)实验室操作用柱色谱比静态吸附效果好，而生产中因当然静态吸附有时效率较高，用什么方式应视具体生产情况而定。
张建新等[6]报道，用离子交换色谱法制备高纯度酶，其特点是上样量较大，在纯化过程中流速较快，纯化中间体只需一步即可达到质量标准的要求，但该文未报道所用交换剂的型号。
汪晓英等[7]报道的制备方法基本流程与周祖荫等[5]的类似，部分条件有些差异，也是以DEAE-纤维素为交换剂。
1.3盐析与疏水色谱相结合工艺
将胰激肽原酶粗品溶于10 %饱和度的硫酸铵溶液，离心取上清液，加入硫酸铵粉末使溶液达到35 %饱和度，再离心取上清液，加入硫酸铵达70 %饱和度，离心，沉淀溶解后进行疏水色谱。
以Buty1 Sepharose FF为介质；平衡缓冲液为10 mmol/L Na2HPO4/ NaH2PO4+1.0 mol/L (NH4)2SO4(pH 6.5)；洗脱缓冲液为10 mmol/L Na2HPO4/ NaH2PO4(pH 6.5)。通过盐析和柱色谱可除去大部分杂质，得到比活大于500 u/mg的胰激肽原酶，收率为85.6 %[8]。
由于疏水色谱在较高盐浓度条件下操作，此工艺经过盐析后的上清液中盐浓度较高，70%硫酸铵盐析后的沉淀含有较多的盐，其溶解液不宜作离子交换色谱，但在溶解液中再加少许盐调整后可直接作为疏水色谱的进料。疏水色谱收集的非目标蛋白质洗脱液可作为分离其他酶如弹性酶，糜胰蛋白酶等的原料。
1.4联产工艺
周祖荫等[9]报道了一种胰激肽原酶、弹性酶和糜胰蛋白酶的联产工艺。以猪胰脏的丙酮脱水干燥粉为原料，用适当溶液提取，提取液中加CM-纤维素吸附，对吸附后CM-纤维素的洗脱液用丙酮沉淀，得糜胰蛋白酶。CM-纤维素吸附后的溶液中加DEAE-纤维素吸附，洗脱液用丙酮沉淀，得胰激肽原酶。猪胰脏丙酮脱水干燥粉经提取后的残渣，再用另一种溶液提取，提取液中加CM-纤维素吸附，洗脱液用丙酮沉淀，得弹性酶。
1.5 其他相关问题和讨论
制备胰激肽原酶粗品的方法较多[1]，主要可分为两类：一类是用丙酮、乙醇等有机溶剂进行分级沉淀；再一类是由硫酸铵、硫酸镁或醋酸镁等进行分段盐析。两类方法相结合可获得良好的效果。如胰脏经丙酮脱水的粉末，先用较低浓度的醋酸镁盐析，溶液调pH至7.5～8.0使胰激肽原酶充分溶解，再用丙酮分级沉淀，可制得质量较好的粗品，且收率较高。
粗品的纯化(精品的制备)，关键是筛选良好的吸附剂 ......
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