报告基因的应用研究进展
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摘要：目前报告基因作为一种有效技术已在农学、生物医学、生命科学和环境科学等领域起着重要的作用。现以荧光素酶和绿色荧光蛋白为例，综述报告基因的新近应用研究进展。
关键词：报告基因；荧光素酶；绿色荧光蛋白
中图分类号：R962文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)09-0045-04
报告基因(report gene)是指一组编码易被检测的蛋白质或酶的基因，将其与目的基因融合表达后，可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。这项技术灵敏度高、检测简便可靠、适于大规模生产，因而在监测细胞信号转导，基因表达和药物筛选等方面得到广泛应用。一般的报告基因需要满足以下几个条件：(1)基因被克隆并且已知全序列；(2)宿主不存在报告基因产物或者不存在类似的内源性物质；(3)表达产物易被检测；(4)报告分子的分析结果应具有很宽的线形围，以便分析启动子活性的幅度变化[1]；(5)报告基因在细胞或动物内表达对其正常的生理作用或活性没有影响。现主要以目前应用最广泛的报告基因荧光素酶和绿色荧光蛋白为例，综述报告基因的新近应用研究进展。
1荧光素酶(luciferase，luc)
luc是能催化荧光素或者脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。根据来源不同主要分为细菌荧光素酶(bacterial luciferase，BL)、萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，FL)以及以海星、发光鱼、发光甲虫等为来源的荧光素酶，目前研究最广泛并且成为商品酶的是BL和FL。BL是由2个多肽亚基组成的异源二聚体，相对分子质量约为79×103，在还原性黄素(FMNH2)、八碳以上长链脂肪醛(RCHO)和氧分子(O2)存在时，发射出蓝绿光(450～490 nm)。FL由单一的多肽链组成，相对分子质量为(60～64)×103，在Mg2+、ATP、O2 存在时催化D-荧光素(D-Luciferin)氧化脱羧发光(550～580 nm)[2]。由于luc的检测方法简便，灵敏度高，因而成为目前应用最广泛的报告基因之一。
1.1基因表达研究
目前检测luc的灵敏度可达到10～19 mol且价格相对较低，是基因表达研究中首选的报告基因。娄桂予等[3]用luc作报告基因，研究肝细胞核因子1α(HNF1α)对人胆汁酸受体(FXR)转录激活的作用机制，发现HNF1α与FXR启动子区域-65到-48的反向半位点结合，发挥反式激活作用，从而调控FXR基因表达。徐春娥等[4]将获得的IFN-β启动子基因连入pGL3-Enhancer载体，用luc作报告基因构建了质粒IP-21，将IP-21瞬转入稳定表达有SARS-CoV非结构蛋白3a和7a的CHO细胞，观察3a和7a对干扰素诱生途径的影响。结果显示，3a和7a蛋白增强了荧光素酶的表达，说明3a和7a能有效激活IFN-β的启动子部分。
1.2蛋白质间相互作用研究
作为一种酶性报告基因，luc对标记对象和宿主没有损害。特别是可视化检测技术的发展使空间定位观察成为可能，为研究蛋白质的磷酸化、空间表达及蛋白质间的相互作用提供了新的途径。北京大学精神卫生研究所利用嵌合酵母活性转录因子(Gal4)-单纯疱疹病毒蛋白(VP16)-上游激活序列(UAS)和双荧光素酶报告基因系统，建立了检测γ-分泌酶切割阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease, AD)中β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein, Aβ)活性的方法，有效可靠，灵敏度高[5]。
1.3毒性物质检测研究
传统的利用luc检测毒性物质的原理是毒性物质可能会抑制发光菌发光，根据发光强度的变化判断抑制物毒性作用的大小。但此种方法应用范围较窄，实际操作受限。随着分子生物学技术的发展，人们开始利用基因工程技术将luc报告基因插入某些特异性敏感的基因序列中，构建会发光的生物传感器检测环境中的毒性物质。目前美国Xenobiotic Detection System Intermational公司利用FL作报告基因开发出一种转基因细胞，用于测定样品中二恶英的总毒性当量(total toxic equivalencies，TEQ)。研究表明，二恶英类化合物(dioxin2like chemicals，DLCs或DXNs)产生毒性作用必须与机体细胞核内的二恶英反应增强子结合。根据这一原理，将FL融合入哺乳动物细胞的细胞色素P450基因(CYP1A1)作为报告基因，再转染入H4ⅡE大白鼠肝癌细胞系表达。当外源性DXNs污染物透过细胞膜特异性地与染色体上二恶英应答区域结合，激活细胞色素P450基因和FL基因合成荧光素，此时的荧光强度与DXNs物质的量成正比，就可根据系统的荧光强度分析DXNs的TEQ[6]。
1.4RNA干扰研究
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的，由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发，同源mRNA高效特异性降解的现象，是一种典型的转录后基因表达调控方式。由于研究有巨大的潜力，Science杂志将其评为2001年的10大科学进展之一，并名列2002年10大科学进展之首。与此同时用luc作报告基因研究RNAi也迅速成为研究热点。尹志华等[7]用GFP和luc作报告基因，通过体外转录合成短干扰RNA(small interference，siRNA)和构建表达短发夹RNA(small hairpin，shRNA)的质粒载体2种方法，检测鼻咽癌细胞系的RNAi作用，获得了理想的效果。何国平等[8]将外源报告基因GFP和luc的表达载体与shRNA的质粒共转染HEK293H细胞后，观察shRNA对报告基因的抑制作用，研究在RNAi技术抑制外源报告基因过程中的剂量和时间效应。发现在一定剂量范围内，RNAi载体抑制效应与干扰载体剂量大小相关，但当剂量加大到足以抑制外源基因表达时，抑制效应将维持在“平台期”。这为今后RNAi技术的应用研究提供了有价值的理论参考依据。
2绿色荧光蛋白(green flourscent protein, GFP)
GFP是一种由238个氨基酸组成的单体蛋白质，相对分子质量为27×103。它具有分子小，荧光稳定，检测方便，而且对活细胞无伤害等优点，成为众多报告基因中的后起之秀，被称为“活细胞的分子探针” ......
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