过氧化氢和氨基酸混合液对谷胱甘肽发酵影响的研究
摘要：目的 考察过氧化氢和氨基酸混合液前体对突变株YF(ZnCl2r，Ethr)生产谷胱甘肽(GSH)的影响。方法摇瓶培养，在不同添加时间分别添加不同浓度的过氧化氢和氨基酸混合液前体，测得GSH浓度，细胞干重。结果发酵9 h时添加12 mmol/L氨基酸混合液，GSH浓度提高了99.6 %。而过氧化氢对GSH发酵的影响不大。发酵12 h添加0.3 mmol/LH2O2和18 mmol/L氨基酸混合液，GSH浓度提高了114 %。结论氨基酸混合液能显著促进胞内谷胱甘肽的累积，氨基酸混合液和过氧化氢协同作用可有效的促进胞内谷胱甘肽的累积。
关键词：过氧化氢；混合氨基酸；谷胱甘肽；发酵
中图分类号：TQ920.1文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)07-0019-04
, 百拇医药 Study on Effects of Mixed Amino Acids and Hydrogen Peroxide on Production of Glutathione by Saccharomyces cerevisiae
CHEN Shan, HE Xiao-xian, PAN Ya-lei
(College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an, 710021, China)
Abstract：Objective To investigate the effects of mixed amino acids and hydrogen peroxide on the production of glutathione(GSH)by mutant strain YF(ZnCl2r, Ethr). Methods At the shake flask level, the concentration of GSH and the weight of dry cell were measured with different adding amount of mixed amino acids and hydrogen peroxide at different time points. Results After fermentation for 9 hrs, mixed amino acids of 12mmol/L was added into the medium with the concentration of GSH to be increased by 99.6%. However, hydrogen peroxide could not obviously enhance the intracellular GSH level. After fermentation for 12 hrs, hydrogen peroxide of 0.3mmol/L and mixed amino acids of 18mmol/L were both added into the medium with the concentration of GSH to be increased by 114%. Conclusion Mixed amino acids can enhance the intracellular GSH accumulation in shaking flask culture and the synergy of mixed amino acids and hydrogen peroxide can also increase the intracellular GSH accumulation.
, 百拇医药
Key words：hydrogen peroxide; mixed amino acids; glutathione; fermentation
谷胱甘肽(glutathione，GSH)，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成，具有γ-谷氨酰基和巯基生物活性的一种三肽化合物。本课题用H2O2刺激突变株YF(ZnCl2r，Ethr)，研究它对GSH合成的影响。
微生物细胞是一个经济的体系，不会在胞内过量积累某一代谢产物。细胞只有处于不正常的生理状态下，出于保护自身的本能和抵御外界伤害时，才会对其代谢产物做出调整。人为提供适当的环境刺激，极有可能促进细胞合成目标代谢产物的能力。Riccillo[1]指出在极端环境下GSH对Rhizobium tropici的生存起着至关重要的作用。Duwat[2]也说明在L.lactis中外界胁迫作用下GSH对保护细胞生存具有重要意义。表明GSH在微生物细胞面临外界环境条件刺激和胁迫时，存在至关重要的抵御作用和响应机制，是细胞抗损伤及代谢调节的关键物质之一。基于此原理利用过氧化氢刺激细胞可提高目标产物产率。
, 百拇医药
此外，H2O2作为携氧剂可以分解成水和氧气，给细胞提供生长和代谢所需的氧。突变株YF(ZnCl2r，Ethr)发酵是好氧发酵，添加H2O2的同时也起到提高溶氧的作用，有助于细胞的生长和代谢[3]。加入H2O2还有细胞毒性低、成本低、操作简单及不会为产物分离带来困难等优点。
培养基中添加谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸可能会促进酵母胞内积累GSH。通常条件下的GSH发酵生产所需的这3种氨基酸是通过微生物细胞在糖类代谢基础上，经过一系列生化反应后自身合成的，其合成途径很容易受到细胞自身性能、状况以及外界营养、环境条件的影响。添加氨基酸前体物质可有效的解除限制GSH高产的因素。谭天伟等[4]在S.cerevisiae T65发酵生产GSH过程中，采取先加入半胱氨酸再加入谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸混合物的策略，GSH含量达到1 875 mg/ L，比不加提高了55.2 %。在摇瓶条件下，我们考察了不同浓度和不同添加时间的氨基酸混合液对诱变得到的突变株YF(ZnCl2r，Ethr)细胞生长和GSH合成的影响。这对利用酵母生产谷胱甘肽的研究有着重要意义。
1材料
1.1菌种
突变株YF(ZnCl2r，Ethr)，由本院生物工程实验室保藏。
1.2试剂和培养基
保藏培养基(g/L)：葡萄糖20；蛋白胨20；酵母膏10；琼脂1.5%~2%；pH自然，0.1 Mpa，灭菌15 min。, 百拇医药(陈 珊 贺小贤 潘亚磊)
关键词：过氧化氢；混合氨基酸；谷胱甘肽；发酵
中图分类号：TQ920.1文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)07-0019-04
, 百拇医药 Study on Effects of Mixed Amino Acids and Hydrogen Peroxide on Production of Glutathione by Saccharomyces cerevisiae
CHEN Shan, HE Xiao-xian, PAN Ya-lei
(College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an, 710021, China)
Abstract：Objective To investigate the effects of mixed amino acids and hydrogen peroxide on the production of glutathione(GSH)by mutant strain YF(ZnCl2r, Ethr). Methods At the shake flask level, the concentration of GSH and the weight of dry cell were measured with different adding amount of mixed amino acids and hydrogen peroxide at different time points. Results After fermentation for 9 hrs, mixed amino acids of 12mmol/L was added into the medium with the concentration of GSH to be increased by 99.6%. However, hydrogen peroxide could not obviously enhance the intracellular GSH level. After fermentation for 12 hrs, hydrogen peroxide of 0.3mmol/L and mixed amino acids of 18mmol/L were both added into the medium with the concentration of GSH to be increased by 114%. Conclusion Mixed amino acids can enhance the intracellular GSH accumulation in shaking flask culture and the synergy of mixed amino acids and hydrogen peroxide can also increase the intracellular GSH accumulation.
, 百拇医药
Key words：hydrogen peroxide; mixed amino acids; glutathione; fermentation
谷胱甘肽(glutathione，GSH)，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成，具有γ-谷氨酰基和巯基生物活性的一种三肽化合物。本课题用H2O2刺激突变株YF(ZnCl2r，Ethr)，研究它对GSH合成的影响。
微生物细胞是一个经济的体系，不会在胞内过量积累某一代谢产物。细胞只有处于不正常的生理状态下，出于保护自身的本能和抵御外界伤害时，才会对其代谢产物做出调整。人为提供适当的环境刺激，极有可能促进细胞合成目标代谢产物的能力。Riccillo[1]指出在极端环境下GSH对Rhizobium tropici的生存起着至关重要的作用。Duwat[2]也说明在L.lactis中外界胁迫作用下GSH对保护细胞生存具有重要意义。表明GSH在微生物细胞面临外界环境条件刺激和胁迫时，存在至关重要的抵御作用和响应机制，是细胞抗损伤及代谢调节的关键物质之一。基于此原理利用过氧化氢刺激细胞可提高目标产物产率。
, 百拇医药
此外，H2O2作为携氧剂可以分解成水和氧气，给细胞提供生长和代谢所需的氧。突变株YF(ZnCl2r，Ethr)发酵是好氧发酵，添加H2O2的同时也起到提高溶氧的作用，有助于细胞的生长和代谢[3]。加入H2O2还有细胞毒性低、成本低、操作简单及不会为产物分离带来困难等优点。
培养基中添加谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸可能会促进酵母胞内积累GSH。通常条件下的GSH发酵生产所需的这3种氨基酸是通过微生物细胞在糖类代谢基础上，经过一系列生化反应后自身合成的，其合成途径很容易受到细胞自身性能、状况以及外界营养、环境条件的影响。添加氨基酸前体物质可有效的解除限制GSH高产的因素。谭天伟等[4]在S.cerevisiae T65发酵生产GSH过程中，采取先加入半胱氨酸再加入谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸混合物的策略，GSH含量达到1 875 mg/ L，比不加提高了55.2 %。在摇瓶条件下，我们考察了不同浓度和不同添加时间的氨基酸混合液对诱变得到的突变株YF(ZnCl2r，Ethr)细胞生长和GSH合成的影响。这对利用酵母生产谷胱甘肽的研究有着重要意义。
1材料
1.1菌种
突变株YF(ZnCl2r，Ethr)，由本院生物工程实验室保藏。
1.2试剂和培养基
保藏培养基(g/L)：葡萄糖20；蛋白胨20；酵母膏10；琼脂1.5%~2%；pH自然，0.1 Mpa，灭菌15 min。, 百拇医药(陈 珊 贺小贤 潘亚磊)